目的:探究基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估新方法,开发新的基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估新体系。方法:选取质粒中博来霉素抗性基因作为实验候选报告基因。在原核系统构建Amp-Zeocin双抗质粒。同时在Zeocin抗性基因起始密码子ATG与第二密码子GCC间加入Bae I酶切位点,可实现金门克隆插入核酸片段方法。在真核体系构建G418/Kana-Zeocin双抗质粒,同时也在Zeocin抗性基因起始密码子ATG与第二密码子GCC间加入Bae I酶切位点,可实现金门克隆插入核酸片段方法。在候选报告基因中加入不同长度(包括3的整数倍和非3的整数倍)、不同种类(含有终止密码子和不含有终止密码子,指定序列和任意序列)的核酸片段,观察其抗性的保留与否;将人工构建的失活抗性基因使用基因编辑工具造成双链断裂,加入同源oligo,促使其在E.coil中发生同源重组重新恢复活性,验证其抗性功能的转换能力。结果:成功构建双抗质粒,在原核和真核系统中均可实现理想的“移码/终止——抗性消失,不移码——抗性保留”的二元模式,且移码或提前终止造成的抗性消失可通过基因编辑工具的剪辑作用得到重组恢复。结论:博来霉素抗性基因可用于基因编辑工具剪切效率和脱靶效应评估报告基因。