研究目的:表观遗传是指由染色体变化而不改变DNA序列引起的稳定可遗传表型。最常见的表观遗传变化包括DNA甲基化,组蛋白修饰和非编码微小RNA（miRNA）。多项研究报道,表观遗传调控异常会导致多种疾病,比如心血管疾病、肝病等,尤其是癌症。通过调控表观遗传变化,进而治疗或逆转疾病成为当前的研究热点。G9a是由EHMT2基因编码,具有SET结构域的组蛋白甲基转移酶,是一种关键的表观遗传酶。G9a在多个癌种中高表达,如肺癌、乳腺癌、肝癌等,且G9a在肿瘤的发生发展中起重要作用。因此G9a抑制剂对高表达G9a的肿瘤有明显的治疗作用。目前开发的G9a抑制剂没有专属性,并且仅限于临床前研究。因此开发特异性针对G9a并可用于临床研究的G9a抑制剂具有重要意义。此外,肺癌的发病率和死亡率位于全球癌症榜首,是严重危害人类健康和生命的疾病。研究发现,G9a在肺癌中高表达,但其在肺癌中的作用机制尚不明确。因此,开发G9a专属性小分子抑制剂,研究G9a对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞功能学表型的影响以及G9a专属小分子抑制剂对NSCLC的作用机制具有重要临床意义。研究方法:1.评价多个癌细胞中G9a的基础表达分别选取NSCLC细胞系A549、H1299、H1975,乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和卵巢癌细胞系SK-OV-3、OVCAR3、结肠癌细胞系HT29、肝癌细胞系Huh7、HepG2以及肾癌细胞系786-O-R,采用western blot实验检测不同肿瘤细胞中G9a蛋白的表达水平,又进一步采用免疫荧光实验确证G9a在肿瘤细胞中基础表达。2.检测G9a对NSCLC细胞系H1299迁移能力的影响H1299细胞经过质粒转染6-8h后,敲低H1299细胞中G9a的表达,培养24h后采用划痕法检测G9a对H1299细胞迁移能力的影响。3.考察G9a对H1299细胞增殖的影响H1299细胞经过质粒转染6-8h后,敲低H1299细胞中G9a的表达,培养24h收集细胞接种于6孔板（极低密度,200细胞/孔）,培养14天后通过吉姆萨染色,检测G9a对H1299细胞增殖能力的影响。4.考察G9a对H1299细胞干性的影响H1299细胞经过质粒转染6-8h后,敲低H1299细胞中G9a的表达,培养24h收集细胞,流式细胞术检测细胞干性标志物CD44+和CD133+的表达,考察G9a对H1299细胞干性的影响。5.考察G9a对H1299细胞自噬的影响H1299细胞经过质粒转染6-8h后,敲低细胞中G9a的表达,培养24h后用Cyto-ID试剂盒的染料孵育半小时后收集细胞,流式细胞术检测细胞细胞自噬情况。6.考察一线化疗药物对G9a低表达的H1299细胞的药效H1299细胞经过质粒转染6-8h后,敲低细胞中G9a的表达,培养24h后收集细胞接种于96孔板,给顺铂和紫杉醇处理72h后,SRB实验检测细胞存活情况。7.细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）方法考察天然小分子化合物和结构改造化合物与G9a的结合能力收集H1299细胞,液氮反复冻融联合RIPA裂解蛋白的方法提取总蛋白,经过蛋白裂解液与天然小分子化合物、结构改造化合物或者溶剂孵育后,不同温度加热后提取可溶性成分,采用western blot方法考察G9a蛋白的表达,比较溶剂组和化合物组中G9a表达,筛选得到与G9a结合的化合物。8.表面等离子共振（Surface plasmon resonance,SPR）方法进一步筛选天然小分子化合物和结构改造化合物与G9a特异性结合能力将G9a蛋白固定在GLH芯片上,通过微流系统将含有化合物的溶液注射到G9a表面上。当化合物结合到G9a表面时,可以观察到SPR信号增加（以响应单位表示,RU）,从而筛选出与G9a直接结合的化合物,并且计算出化合物与G9a结合的结合常数KD。9.磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B,SRB）比色法考察目标化合物对NSCLC细胞活力的影响选择H1299、A549两种NSCLC细胞系,根据SRB实验的实验步骤,检测目标化合物处理72h后细胞存活情况并计算IC50值,选取合适的给药浓度作为体外研究模型,同时考察化合物对正常人肺上皮细胞Beas-2B的细胞毒性。10.EdU法评价化合物LZL072、LZL082对NSCLC细胞增殖的影响。化合物LZL072、LZL082处理H1299和A549细胞72 h,EdU稀释液孵育2h,进行Apollo染色,荧光显微镜检测EdU的掺入率,评价化合物LZL072、LZL082对NSCLC细胞增殖的影响。研究结果:1.NSCLC细胞H1299中G9a的基础表达最高根据western blot实验和免疫荧光实验考察癌细胞中G9a的表达,发现H1299细胞中G9a表达最高,将H1299细胞选择作为后续实验研究对象。2.G9a低表达显著抑制H1299细胞的迁移通过质粒转染方法,H1299细胞中G9a蛋白和基因表达水平降低,进一步的划痕实验结果显示,与正常的H1299细胞相比,G9a低表达的H1299细胞迁移能力明显下降（P<0.001）,迁移抑制率达到30%。3.G9a低表达显著抑制H1299细胞的增殖通过质粒转染方法,H1299细胞中G9a蛋白和基因表达水平降低,平板克隆实验结果显示,与正常的H1299细胞相比,G9a低表达的H1299细胞增殖能力显著抑制（P<0.001）,增殖抑制率达到61%。4.G9a低表达对H1299细胞干性无明显影响采用质粒转染方法,降低H1299细胞G9a蛋白和基因水平,再通过流式细胞术检测表达CD133+和CD44+细胞所占的比例,结果显示,与H1299细胞相比,G9a低表达的H1299细胞中CD133+和CD44+比例变化影响不明显。5.G9a低表达促进H1299细胞产生自噬采用质粒转染方法,降低H1299细胞G9a蛋白和基因水平,再通过CYTO-ID试剂盒联合流式细胞术的结果显示,与正常的H1299细胞相比较,G9a低表达的H1299细胞产生自噬的细胞明显增加（P<0.001）,产生自噬的细胞比正常细胞高60%。6.G9a低表达增强一线化疗药物的体外药效SRB实验结果显示,顺铂（Cisplatin,DDP）和紫杉醇（Paclitaxel,PTX）在正常H1299细胞上作用72h,IC50值分别为7.29±0.79μM和11.66±2.8nM,而在G9a低表达的H1299细胞中作用72h,IC50值分别为2.64±0.44 μM和8.97±3.9 nM。一线化疗药物顺铂和紫杉醇对G9a低表达的H1299细胞的药效增强,IC50分别降低2.7倍和1.3倍。7.CETSA方法筛选得到4个天然小分子化合物和6个结构改造化合物与G9a有结合作用细胞热转移分析（CETSA）方法考察与G9a结合的实验结果显示,有4个天然小分子化合物（35558、28990、20710、80814）和6个结构改造化合物（LZL087、LZL030、LZL103、LZL026、LZL082 和 LZL025）与 G9a 有结合作用。8.SPR实验筛选出3个结构改造化合物与G9a结合首先通过10μM浓度初步筛选出与G9a具有中度结合的10个化合物,包括LZL007>LZL007-2>LZL082>LZL033>LZL079>LZL015>LZL072>LZL024>LZL078>LZL025,后续进行浓度梯度实验时,得到三个与G9a有中强度结合的化合物并计算结合常数 KD,分别是 LZL033（KD=15.7μM）、LZL072（KD=6.79 μM）、LZL（KD=22.4 μM）。9.结构改造化合物LZL033、LZL072、LZL072显著抑制A549和H1299细胞的活力结构改造化合物 LZL033（0-50 μM）,LZL072（0-50μM）和 LZL082（0-50μM）处理H1299和A549细胞72h,计算IC50值。在H1299中的IC50值分别为5.75 μM,3.54μM,11.09 μM,而在 A549 中分别为 6.31 μM,7.92 μM,6.90μM。10.化合物LZL072、LZL082显著抑制H1299和A549细胞的增殖。随着给药浓度的升高,荧光粒子数逐渐减少,EdU掺入率降低。表明化合物LZL072、LZL082均可显著抑制H1299和A549细胞的DNA的合成,从而抑制细胞增殖（P<0.001）。结论:本文研究了 G9a对非小细胞肺癌H1299细胞功能的影响,发现G9a低表达显著抑制H1299细胞的迁移、细胞增殖能力、促进自噬、增强一线化疗药对H1299细胞活力的影响,证实G9a在肺癌发生发展中发挥重要作用。通过CETSA和SPR实验筛选出的化合物LZL033、LZL072、LZL082,可与G9a特异性结合、具有抗肿瘤活性。综上所述,LZL033、LZL072、LZL082可作为G9a表观遗传修饰剂,与G9a结合并抑制其表达,从而调控NSCLC,为G9a抑制剂的发展提供实验依据并未表观遗传学防治肿瘤提供新思路。