EphA/EphrinA信号系统在小鼠视网膜细胞发育中的表达与意义

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目的:研究EphA/EphrirA信号系统在正常小鼠的视网膜发育过程中的表达,探讨EphA/EphrinA在视觉发育过程中的意义与视网膜感光细胞轴突生长中的导向作用。方法:1.饲养发育正常新生C57BL/6小鼠60只,在其生长至出生后第1天(P1)、第3天(P3)、第5天(P5)、第7天(P7)、第9天(P9)及4周时随机选取小鼠10只,麻醉后在解剖显微镜下分离同时期的小鼠眼球20只。其中10只眼球解剖后只保留其视网膜,另外10只保持眼球完整性。2.将步骤1中分离的5只完整眼球制成石蜡切片,经HE染色在光镜下可见不同日龄段的小鼠视网膜发育情况,特别是P5-P9期间小鼠视网膜外丛状层的形成过程。3.将步骤1中分离出的10只小鼠视网膜提取mRNA,用RT-PCR的方法检测EphA/EphrinA信号家族中各个亚类在视网膜的表达情况,筛选出表达量最高的亚类EphA4。4.将步骤1中另外5只完整的小鼠眼球制作成冰冻切片,用步骤3中筛选出的亚类EphA4抗体及特异性表达小鼠感光细胞和双极细胞的Recoverin抗体,行免疫荧光染色实验,观察小鼠视网膜感光细胞轴突生长情况及外丛状层的形成过程。结果:1小鼠视网膜发育中各时期的形态变化。P1-P3时期小鼠视网膜结构较为单纯,内核层及外核层尚未分出,外丛状层未形成,感光细胞由感光前体细胞分化出,散在分布于神经母细胞层,轴突短细,P5-P7时期视网膜感光细胞成熟,轴突结构趋于完整,向内生长与内核层中新分化出的双极细胞联系,形成外丛状层,至P9时期,视网膜的各层细胞结构基本稳定,外丛状层结构清晰明确。2. EphA/EphrinA在小鼠的视网膜中的表达。运用GraphPad Prism绘制出统计图表显示EphA4在小鼠视网膜中整体表达量最高,EphA6与EphrinAl在视网膜中无表达,EphA4在各个时间点,运用SPSS17.0统计软件进行单因素反差分析,N=3,得出均数士标准差:P1(0.48±0.33),P3(0.55±0.23),P5(0.76±0.11),P7(1.12±0.88,),P9(0.74±40.08),,4W(0.66±0.07),P<0.05,差异有统计学意义。3.不同时期小鼠视网膜Recoverin及EphA4表达。P1至P3阶段可见Recoverin表达于小鼠视网膜感光细胞胞膜及胞体,散在分布于神经母细胞层,EphA4主要表达于神经节细胞与内丛状层,P5-P7可见Recoverin表达的感光细胞轴突发育成熟,外丛状层形成,个别感光细胞散在于内核层中表达,轴突延伸至内核层,EphA4表达于节细胞层至内核层,较P1-P3期表达强烈。P9中Recoverin强表达于外核层中感光细胞的胞膜、胞体及轴突上,可见感光细胞成熟形态,轴突集中至外丛状层,外丛状层稳定形成,双极细胞在内核层初步形成,亦有Recoverin的较弱表达,EphA4在内丛状层及外丛状层的表达最为强烈,形成两条平行的荧光带,而外核层中基本未见其表达。结论:1.EphA/EphrinA信号家族中EphA4可能参与正常小鼠视网膜的发育过程。2.Recoverin阳性细胞主要分布在小鼠视网膜外层, EpmA4阳性细胞主要分布在视网膜内层,EphA4对于感光细胞向内生长可能有驱避作用。
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