【摘 要】
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目的:研究类骨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子对骨肉瘤细胞的抑制作用,探讨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子诱导骨肉瘤细胞自噬和凋亡并抑制肿瘤细胞增殖的潜在机制作用,证实类骨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子较普通形貌材料有更好的抗骨肉瘤作用。方法:（1）制备不同形貌的硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子（selenium-doped hydroxyapatite nanoparticles,Se-HAN）,并通过CCK-8法检测不同形
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目的:研究类骨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子对骨肉瘤细胞的抑制作用,探讨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子诱导骨肉瘤细胞自噬和凋亡并抑制肿瘤细胞增殖的潜在机制作用,证实类骨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子较普通形貌材料有更好的抗骨肉瘤作用。方法:（1）制备不同形貌的硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子（selenium-doped hydroxyapatite nanoparticles,Se-HAN）,并通过CCK-8法检测不同形貌Se-HANs对MNNG/HOS和MG63骨肉瘤细胞增殖作用的影响;（2）细胞凋亡的检测:利用Hoechst 33258染色、Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术、Western Blot实验检测细胞凋亡水平及相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-8,cleaved caspase-9和cleaved PRAP的表达;（3）细胞自噬的检测:利用m RFP-GFP-LC3腺病毒转染实验、Western Blot和透射电镜观察细胞自噬水平及相关蛋白LC3B、Beclin-1、P62的表达;（4）自噬和凋亡间的关系:利用CCK-8检测加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）或（和）凋亡抑制剂z-VAD后骨肉瘤细胞的细胞活性;（5）信号通路的研究:用Western Blot检测不同形貌Se-HANs干预后骨肉瘤细胞AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR、JNK、p-JNK蛋白的表达;使用AKT/m TOR通路抑制剂MK-2206和rapamycin,ROS清除剂Mn TMPy P和JNK通路抑制剂SP600125,并利用Western Blot检测纳米材料处理肿瘤细胞后LC3B、cleaved caspase3蛋白及各自通路相关蛋白p-AKT、p-m TOR、p-JNK蛋白的表达;（6）侵袭和迁移能力的影响:利用划痕试验、Transwell侵袭实验以及Western Blot来检测不同形貌Se-HANs对MNNG/HOS细胞迁移、侵袭能力的影响;（7）建立裸鼠胫骨骨肉瘤原位模型,记录模型鼠体重、肿瘤大小、患肢X线、micro CT、免疫组织化学方法来评估不同形貌Se-HANs体内治疗的效果。结果:（1）Se-HANs抑制了骨肉瘤MNNG/HOS和MG63细胞的增殖,诱导骨肉瘤细胞的凋亡和自噬;仿生类骨硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子（biomimetic bone-like selenium-doped hydroxyapatite nanoparticles,BBL-Se-HAN）较针状形貌硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子（needle-like,NL-Se-HAN）和短棒形貌硒掺杂羟基磷灰石纳米粒子（Rod-like,,RL-Se-HAN）有更强的抑制增殖、促进凋亡和自噬的作用;（2）加入自噬抑制剂3-MA或z-VAD后,增加了Se-HANs处理后骨肉瘤MNNG/HOS细胞的细胞活性;而联合使用两种抑制剂后,较单独使用一种抑制剂,BBL-Se-HAN对骨肉瘤细胞活性的抑制作用进一步得到限制,证明BBL-Se-HAN诱导骨肉瘤MNNG/HOS细胞产生的自噬是抑制细胞活性的;（3）BBL-Se-HAN可以产生过量的ROS介导AKT/m TOR通路的下调和JNK通路的上调来促进MNNG/HOS细胞自噬,并介导JKN通路的上调来促进凋亡,从而抑制骨肉瘤MNNG/HOS细胞的增殖;（4）划痕试验和Transwell侵袭实验证明Se-HANs可以抑制骨肉瘤MNNG/HOS细胞的运动和侵蚀能力,并且BBL-Se-HAN较普通的NL-Se-HAN、RL-Se-HAN有更强的抑制作用;Se-HANs是通过降低MNNG/HOS细胞中MMP9和MMP3蛋白的表达和活化来抑制骨肉瘤细胞的运动和侵袭能力;（5）体内实验也表明,Se-HANs可以使骨肉瘤MNNG/HOS细胞产生过量的ROS并诱导自噬和凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖能力以及骨破坏和异常成骨效应,并且BBL-Se-HAN较非仿生的NL-Se-HAN、RL-Se-HAN有更强的抑制作用;
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