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【研究背景】原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma,POAG）是临床常见的青光眼类型之一。房角小梁网细胞（trabecular meshwork cells,TMCs）功能及组织结构变化所导致的房水排出障碍、进一步引起病理性眼内压（intraocular pressure,IOP）增高,是POAG患者视神经损害最主要的危险因素。眼压增高持续时间愈久,视功能损害愈严重。疏通房角解除房水阻滞以降低眼内压是目前被证实最有效的治疗POAG的方法。已有研究证实,活性氧（reactive oxygen species,ROS）在POAG患者房水及小梁网组织中大量表达,说明POAG患者眼内处于氧化应激状态。氧化应激作为一种重要的致病因素,可引起小梁网schlemm管（trabecular meshwork-schlemm canal,TM/SC）内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）异常沉积,使小梁网组织的正常生理结构发生改变,增加房水流出阻力,导致病理性眼压升高。自噬是一种细胞内高度保守的分解代谢过程,通过溶酶体循环降解细胞中多余的蛋白质和受损的细胞器,以此来维持细胞内的稳态。研究表明氧化应激下的自噬可以加速ROS的清除,而纤维化疾病中的自噬也对胶原等ECM相关蛋白具有降解作用。在表观调控的研究中,长链非编码RNAs（long noncoding RNAs,lnc RNAs）和互作蛋白起到重要的调控作用。lnc RNAs通常不编码蛋白质,曾经被认为是转录过程中的副产物,不具有生物学功能。然而,近年来的许多研究表明,lnc RNAs以转录增强子等调控元件的形式参与了基因的表达调控,包括转录与转录后调控;并且参与了染色体沉默、染色质修饰、原癌基因活化等多种重要的调控过程。已有研究表明,lnc RNAs在不同类型眼病的眼组织中有差异表达,可能参与眼病的发生发展,但其具体机制多未被揭示。尽管自噬在清除ROS及ECM相关蛋白中起着关键作用,但lnc RNAs在氧化应激诱导的TMCs自噬中的调控作用及机制尚不清楚。【研究目的】探索lnc RNAs对TMCs氧化应激状态下自噬的调控作用,并揭示其具体调控机制。【研究内容及方法】1.不同浓度H2O2体外刺激TMCs诱导氧化应激,利用荧光探针检测ROS表达水平,通过CCK-8和流式细胞技术检测TMCs的活性变化及凋亡情况,实时定量聚合酶链式反应（quantitative Real-time RT-PCR,RT-q PCR）和蛋白免疫印迹法（western blot）检测ECM相关基因及蛋白的表达水平,最终确定适宜的刺激浓度;2.GFP-m RFP-LC3双标腺病毒示踪观察细胞氧化应激状态下自噬发生情况,检测ROS表达水平,WB检测自噬相关标志物及ECM相关蛋白表达水平,利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）探索自噬在细胞氧化应激状态下的作用;3.转录组高通量测序,并利用生物信息学分析差异表达的lnc RNAs和m RNAs,筛选与自噬可能相关的RNAs,进行RT-q PCR验证;4.针对筛选到的基因设计特异性si RNA以下调其表达,检测ROS表达和自噬发生情况,检测自噬相关标志物及ECM相关蛋白表达水平;5.通过RNA-pull down、质谱（mass spectrometry,MS）查找lnc RNA互作蛋白,并通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）进行反向验证,利用数据库预测两者的结合位点;6.特异性si RNA敲低互作蛋白表达水平,检测靶m RNA及其编码蛋白表达水平,明确互作蛋白对靶m RNA的调控作用。【研究结果】1.过氧化氢（H2O2）刺激h TMCs后,ROS平均荧光强度增加、ECM相关蛋白及其编码基因表达升高、自噬小体增多、自噬膜蛋白表达水平升高,与对照组相比,差异均具有统计学意义（p<0.05）。2.转录组测序结果提示lnc RNA-ENST0000523905和肿瘤蛋白53核蛋白1（TP53INP1）在TMCs氧化应激状态下表达显著升高,差异倍数均>2,p<0.05.3.RT-q PCR及免疫印迹结果显示:抑制ENST0000523905的表达可下调TP53INP1的表达。4.同3-MA处理后的结果一致,敲低TP53INP1或ENST0000523905的表达,可减少H2O2诱导的TMCs自噬小体数量、下调自噬膜蛋白表达、促进ROS平均荧光强度增高及ECM相关蛋白表达增多,与对照组相比,差异均具有统计学意义（p<0.05）。5.RNA-pull down、MS及RIP结果提示:ENST0000523905可直接与C/EBPβ结合。6.RT-q PCR及免疫印迹结果显示:下调C/EBPβ的表达可抑制TP53INP1的转录表达水平,差异具有统计学意义（p<0.05）。【研究结论】1.自噬可促进氧化应激状态下小梁网组织中ECM的降解清除,可能参与青光眼病理过程。2.ENST0000523905对TP53INP1的转录表达发挥顺式正向调控作用,二者均参与了氧化应激状态下TMCs的自噬水平调控。3.ENST0000523905可能通过与C/EBPβ结合促进TP53INP1的转录表达而增强自噬,从而减少TMCs氧化应激状态下的ROS及ECM相关蛋白堆积。