半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分是木聚糖（xylan）。木聚糖的来源不同，分枝程度不同，其主链和支链带有多种不同的取代基团。由于木聚糖结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。β-1，4-内切木聚糖酶（EC.3.2.1.8）能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，因此是木聚糖降解酶中最关键的酶。 极端嗜热菌海栖热袍菌能够利用木聚糖发酵，具有二个产木聚糖酶的基因xynA和xynB。本文系统地研究并首次报道了极端嗜热菌海栖热袍菌（Thermotoga.maritima）的第二个产木聚糖酶基因即xynB基因的克隆和在大肠杆菌中的表达、基因重组酶的提纯及其酶学性质研究。得出的主要结论如下：1．xynB基因克隆和在大肠杆菌中的表达 以海栖热袍菌MSB8（Thermotoga maritima MSB8）的基因组DNA为模板，根据xynB基因全序列，设计两对引物，有效地扩增出了xynB基因片段，并进行拓扑TA克隆和DNA序列测定。选用pET28a（+）表达载体，设计了两种构建方案，NdeⅠ-Hind Ⅲ酶切位点并编码了氨基端6×His标签的阳性克隆，在表达过程中在细胞内形成包涵体；NcoⅠ-Hind Ⅲ酶切位点并编码了羧基端6×His标签的阳性克隆表达成可溶且具有生物活性的蛋白，将确定的单菌落作为基因工程菌株保存。 测定的xynB结构基因序列由1044对碱基组成，编码347个氨基酸。根据已知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性调查，XynB与T.sp.strain FjSS3-B.1的XynA的同源性最大，为85％，与T.neapolitana的XynB同源性次之，为82％。与其它木聚糖酶的同源性小于43％。另外，T.maritima MSB8的XynB属于F/10族木聚糖酶，并且只含有单一功能区。2．木聚糖酶XynB的提纯 热处理能够简便地初步纯化在常温菌中表达的耐热木聚糖酶。70℃加热10min处理粗酶液最为理想，可以去掉23％的杂蛋白，同时收率高达91％。 大肠杆菌中表达的木聚糖酶B在羧基端上带有6×His标签蛋白质，用一步Ni-NTA亲和柱层析可使酶的纯度达90％以上。 通过对粗酶提取液的热变性、Ni-NTA亲和柱层析和离子交换柱层析，得到了电泳纯的木聚糖酶XynB，提纯倍数44.4，得率11％。SDS-PAGE表明木聚糖酶XynB的相对分子量为42kDa，与理论推算的分子量（42，333Da）相吻合。一3．木聚糖酶XynB的酶学性质 Xy nB的最适出值为6，14左右，在出值5．14～8．20能保持最高活力的50％以上。该酶表现出很高的pH稳定性，而且在碱性范围内比酸性范围内更稳定。在50’C时，在实验范围内pH值5～12范围内都很稳定；在70℃时，PH值5．5～11．5，甚至在100’C时，pH值6．5～8．5范围内也都很稳定。XynB在最适叫6＊ 下的最适酶反应温度为90’C，而且具有很高的热稳定性。 在0．ide浓度下不同金属阳离子和EDTA对酶活力的影响表明，多种金属阳离子和EDTA对酶活力的影响不大。金属阳离子螫合剂EDTA仅能降低6％的相对酶活力，说明酶反应不需要金属离子的参与。 所用的醇类在合适浓度下都能提高 XynB 从底物 P巾itroPhenylp－D－xylobioside中释放p－nitronhenvl的能力。其中，在 ZM 异丙醇（iso－ProPanol）中，相对酶活力提高至最大，达对照的 2＊倍。另外，从甲醇至辛醇都能在一定程度上增加 XyB的水解速率，并且随着碳链长度的增加，Xyns从底物中释放尸dtrophenyl的相对速率增加。无论30’C或70’C，都是50mM戊醇中entanol）影响最大，分别提高相对水解速率至2．4和2．5倍。 XynB作用的底物比较广泛，其中对PNP卡－xylobioside的 N值非常小，仅0刀095to刀006InM，说明酶与该底物的亲和力非常大。对pNP－pD－xylopyranoside、pNP－p习－cell加ioside、尸卜卜－aI－ar劝inonvranoside和pNP－p－D－ucopyfanoside的 e值分别为 10．4切．6、3．6切．25、10·Zed·9和 1二．9土1．ZInM。4．木聚糖酶XynB的转糖昔化活性 不同醇类对 XynB 7R解pNI，卡Al《yl的iOSidC的影响表明：直碳链的一级结构醇类是最好的受体，二级结构醇类次之，三级结构的醇类最差。另外，根据几c分析产物的浓度，在四种直碳链的一级结构醇类中，正丙醇门）是转糖昔化反应最好的受体。 XyB对五种人工合成底物能够同时催化水解和转糖昔化反应，在转糖昔化反应过程中，添加不同醇类则不同醇类分别作为受体；不添加任何醇类，则水解产物本身作为转糖昔化反应的受体。 以衅书AI－XylopFanosidO和研乃－D－XylobiOSidS为底物的水解模式表明：XyB催化的反应比较复杂，几乎同时催化水解和转糖昔化反应，原始底物消耗完之后，继续水解转糖昔化反应产生的产物。