新城疫(Newcastle disease,ND)是一种由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的鸡和多种禽类发病的急性、高度接触性传染病,广泛分布于世界各地,给养禽业造成了巨大经济损失。目前,ND主要通过疫苗免疫的方式进行防控。区分动物的免疫与感染(Differentiation of infected from vaccinated animals,DIVA)是实现完全控制病毒性疾病的一条必经途径,但目前常用的NDV血清学诊断方法并不能用于DIVA。非结构蛋白V产生于NDV的复制过程中,主要存在于感染病毒的宿主细胞内,但并不参与病毒粒子的装配。常规的NDV灭活疫苗是失去感染能力的病毒粒子,无法在细胞内复制,不会产生新的V蛋白。因此,本研究选择通过检测血清中V蛋白抗体应答水平的差异来区分疫苗免疫与野毒感染。主要研究内容如下:首先,由于NDV的V蛋白是由P基因经RNA编辑作用产生的,其氨基端区域与P蛋白相同,而羧基端区域不同。因此,为了对V蛋白抗体进行特异性检测,排除P蛋白抗体的干扰,本研究利用大肠杆菌原核表达系统表达V蛋白羧基端结构域(Vc)的重组蛋白作为抗原,以保证单一的抗原抗体反应。然后,对获得的重组蛋白Vc进行纯化,并以此作为包被抗原来建立检测新城疫V蛋白抗体的间接ELISA方法。经多次条件优化后,最终确定的最佳ELISA条件如下:抗原包被浓度为1.6μg/mL,血清稀释倍数为1:50,抗原包被方式为4℃过夜,封闭液为7.5%脱脂奶粉,封闭时间为37℃2 h,血清作用时间为37℃60 min,酶标二抗稀释倍数为1:8 000,酶标二抗作用时间为37℃60 min,TMB底物反应时间为室温10 min。本方法中判定阴、阳性的临界值是根据60份NDV阴性血清的ELISA检测结果确定的。本方法使用S/P值作为判定标准,当S/P值≥0.29时判定为阳性,当S/P值≤0.25时判定为阴性,当S/P值介于两者之间时为可疑值。使用该方法对其他禽源病毒的阳性血清进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。此外,该方法的重复性较好,板内重复性试验和板间重复性试验的CV值均小于10%。最后,使用SPF鸡进行动物实验,然后再使用上述建立好的间接ELISA方法检测血清中的V蛋白抗体。检测结果为:(1)PBS组和两组不同的NDV灭活疫苗组的检测结果均为阴性;(2)经两种不同灭活疫苗免疫3周后再感染NDV强毒的鸡群,在攻毒后第7 d、14 d和21 d,V蛋白抗体阳性率分别为60%(6/10)、80%(8/10)、70%(7/10)和50%(5/10)、80%(8/10)、70%(7/10),且经计算,其检测结果的S/P均值都大于0.29;(3)两组不同的NDV弱毒疫苗组仅在接种后第21 d分别检测到20%(2/10)和10%(1/10)的血清样品呈阳性,但抗体水平都比较低,经计算,其检测结果的S/P均值都小于0.25。以上结果表明,NDV疫苗免疫组和免疫后再感染NDV强毒组的V蛋白抗体应答水平存在明显差异。因此,本检测方法可在群体水平上区分ND疫苗免疫与强毒感染。综上所述,本研究利用重组蛋白Vc,成功建立了检测NDV非结构蛋白抗体的间接ELISA方法,能够在群体水平上区分ND疫苗免疫与强毒感染,为NDV血清学诊断、免疫抗体检测及流行病学调查提供了一种新的检测手段,具有较好的应有前景。