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荷叶为莲属植物的成熟叶片,是一种药食两用的天然植物原料。生物碱为荷叶中的主要活性成分,因具有显著的降脂抑菌作用而备受关注。当前荷叶生物碱的药效及其作用机理已较为清晰,但其遗传背景和生物合成机制尚未完全被揭示。本文以课题组已构建的莲高密度遗传连锁图谱和‘中国古代莲’全基因组信息为基础,分别采用QTL定位和基因克隆两种手段开展荷叶生物碱合成路径关键基因的挖掘。主要结果如下：1.以亲本间具较高DNA序列多态性且荷叶碱含量存在显著差异的F1分离群体为研究材料,利用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-UV/MS)测定成熟叶片中5种主要荷叶生物碱及总碱含量；基于已构建的莲遗传连锁图谱和三年表型数据,采用Map QTL5软件的区间作图法共检测到12个与荷叶总碱及5种单体成分相关的显著性QTL,经整合得到4个控制多种生物碱含量的一致性QTL,分别为：控制O-甲基荷叶碱、荷叶碱、总荷叶生物碱含量的Con-qt1-C2-1；控制O-甲基荷叶碱、荷叶碱、番荔枝碱和总荷叶生物碱含量的Con-qt1-C2-2;控制N-甲基荷叶碱、荷叶碱、总荷叶生物碱含量的Con-qt1-C2-3;控制O-甲基荷叶碱、荷叶碱含量的Con-qt1-C4。结合莲基因组注释信息,获得4个QTL区间注释的588个候选基因,包括17个抗逆性相关蛋白基因及一个苄基异喹啉生物碱合成主干路径的关键基因CYP80B的类似基因。2.采用RT-PCR和5’RACE的方法从莲叶片中克隆了三类荷叶生物碱合成路径关键酶基因,分别为：苄基异喹啉路径第一个关键酶S-去甲乌药碱合酶(NCS)基因NnNCS1、NnNCS2、NnNCS3,其开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为486、489、468 bp；N-甲基乌药碱4’-羟化酶基因NnCYP80B1、NnCYP80B2、NnCYP80B3,其ORF分别为1458、1521、1491 bp；催化苄基异喹啉途径走向阿朴啡路径的关键酶基因NnCYP80G,其ORF为1461 bp。检测‘露茗莲’ (高荷叶碱品种)和‘10-48’(低荷叶碱品种)6个不同发育时期叶片和4个不同组织中主要荷叶生物碱含量,并通过qRT-PCR分析7个关键酶基因在两个莲品种中的时空表达和组织特异性表达模式,结果显示：(1)‘露茗莲’的荷叶生物碱主要在叶片中合成和累积,被选为‘高荷叶碱品种’；而‘10-48’的荷叶生物碱主要在花器官中合成和累积,而在叶片中累积较低,故其通常被视为‘低荷叶碱品种’；(2)NnNCS1、NnNCS2、NnCYP80B1、 NnCYP80B3、NnCYP80G可能参与莲叶片中主要生物碱O-甲基荷叶碱、荷叶碱的合成,它们在两个莲品种间的表达差异可能导致了叶片中生物碱含量的差异；而NnNCS3和NnCYP80B2可能主要参与含量较低的N-甲基荷叶碱、番荔枝碱和莲碱及其他未被检测到微量生物碱的生物合成,因而它们的差异表达并未对两个莲品种叶片中生物碱含量的差异造成明显影响；(3)NnNCS1、NnNCS2、NnNCS3可能是影响两个莲品种不同组织间生物碱含量差异的主要基因,NnCYP80B1、NnCYP80B2在不同组织间的差异表达也可能与‘露茗莲’组织间的生物碱含量差异有关,NnCYP80G可能影响‘10-48’不同组织间荷叶生物碱含量的差异。本研究通过QTL定位和基因克隆两种途径挖掘荷叶碱合成相关基因,首次对荷叶生物碱的遗传机制和分子合成背景进行了探究,对于阐明荷叶生物碱的合成调控机制、指导培育高荷叶碱含量莲栽培品种具有重要理论意义与应用价值。