奶牛乳腺炎是奶牛最常见的疾病之一,影响奶牛的产奶量和牛奶品质,严重的可导致奶牛泌乳功能丧失甚至被迫淘汰,大大降低奶牛养殖的经济效益,给养牛业造成巨大的经济损失。同时病原微生物可通过污染的奶制品而感染人,对人类健康造成危害。无乳链球菌是奶牛乳腺炎的主要病原之一,无乳链球菌感染虽不引起乳房明显的脓肿或纤维化,但是可以导致腺体感染,造成产奶量持续减少。其表面免疫相关蛋白(Sip)暴露在细菌的表面,在多种血清型的无乳链球菌菌株中均有表达,是细菌重要的黏附和定植因子之一,具有较好的免疫保护作用和良好的抗原性,是无乳链球菌重要的候选疫苗抗原之一。九种不同血清型菌株Sip蛋白氨基酸序列比较结果显示此蛋白质高度保守。因此,利用此蛋白开发一个迅速有效的检测方法监控无乳链球菌感染,提高乳制品的质量和安全,具有重要的应用价值。本研究参照Gen Bank公布的牛源无乳链球菌Sip基因序列(AF151361)设计一对特异性引物,成功构建p GEX-6p-1-Sip原核表达质粒。经IPTG诱导表达及条件优化,成功在大肠杆菌感受态Rosetta(DE)中表达了分子量为59.8 Ku的无乳链球菌Sip重组蛋白,其优化条件为终浓度1.0 mmol/L IPTG 37℃恒温诱导5 h。纯化的重组蛋白为其后噬菌体的筛选提供了材料。随后,以纯化的无乳链球菌Sip重组蛋白为靶分子,用M13噬菌体c DNA文库,进行4轮噬菌体生物淘选。无乳链球菌Sip蛋白的首轮包被量为10μg/孔,此后每轮依次减半,噬菌体每轮投入量均为1.5×1011 CFU/μL。经过噬菌体淘洗、扩增和滴度测定,最终在总数少于100的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取10个噬菌体蓝斑于摇菌管中进行4.5 h扩增后测定其滴度。扩增后的10个噬菌体分别进行噬菌体与靶分子的噬菌体ELISA亲和能力的测试,检测结果显示,所获取的10个随机噬菌体均与靶分子具有高度的亲和能力,为ELISA方法检测无乳链球菌的建立奠定了基础。利用能与无乳链球菌Sip蛋白结合的噬菌体作为第一抗体,M13多抗作为第二抗体,建立了可快速检测含无乳链球菌奶样的间接ELISA检测方法并进行了条件优化。优化结果为:抗原包被浓度(即敏感度)为10 CFU/mL/孔,噬菌体最佳作用浓度为108 PFU/mL;抗原最佳包被方式确定为37℃包被2 h时后4℃过夜的方式;最佳封闭剂的选择为1.0%BSA磷酸盐缓冲液置37℃封闭3 h;噬菌体最佳孵育时间为60 min;M13多抗1:1000倍稀释孵育45 min;酶标抗体最佳稀释度为1:4000,最佳孵育时间为45 min。并用所建立的间接ELISA检测方法进行了无乳链球菌敏感性、特异性和临床样本的检测,敏感性可检测到10 CFU/mL。临床样本检测了某牧场54份患奶牛乳腺炎的奶样,检测阳性率达14.286%。本实验将噬菌体表面展示技术与ELISA检测方法相结合,为奶牛乳腺炎无乳链球菌提供了简便高效的新型检测方法。