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目的本文是在实验室前期研究认为FGF-2促进肺纤维化的基础上,应用噬菌体肽库筛选靶向FGF-2的结合肽G8,并构建肺纤维化动物模型,探讨靶向FGF-2结合肽G8对肺纤维化的抑制作用,为肺纤维化的治疗提供新途径。方法(1)噬菌体展示肽库筛选靶向FGF-2的小分子肽,并酶联免疫吸附试验(Enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)验证小分子肽G8与FGF-2的结合特异性。(2)Fmoc固相化学方法合成筛选的多肽G8,并优化多肽合成、分离纯化的工艺条件,包括最适缩合剂、最适缩合反应时间、合适的流动相洗脱梯度。(3)在细胞水平上,CCK-8法检测G8对小鼠成纤维细胞L929的毒性作用,CCK-8法检测G8对FGF-2诱导的小鼠成纤维细胞L929增殖的抑制作用,Western-Blot检测此多肽对FGF-2诱导的人非小细胞肺癌细胞H1299表达磷酸化成纤维细胞生长因子受体2(Phosphorylated-FGFR2,p-FGFR2)的抑制作用。(4)在体水平上,构建BLM诱导的SD大鼠肺纤维化模型,通过肺组织苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)Massion染色及免疫组化检测CollagenⅠ、FGF-2在肺组织中的表达水平,研究G8对肺纤维化的抑制作用。结果(1)噬菌体肽库筛选靶向FGF-2结合肽为12肽,我们命名为G8,其理论分子量为1357.56。ELISA结果显示与筛选的其他多肽相比,G8在40μg/ml时能显著与FGF-2结合,具有显著特异性,G8即为目标肽。(2)Fmoc固相合成G8选择Wang-Resin为载体,使用HBTU/DIEA复合缩合剂合成的粗肽纯度为39.552%,而使用HOBt/DIC缩合剂的粗肽纯度为54.247%,粗肽纯度更高,杂肽更少。根据茚三酮显色反应结果,各个氨基酸的最适缩合时间分别为30 min、60 min、75 min,故选择HOBt/DIC为最适复合缩合剂、最适缩合时间30 min、60 min、75 min合成G8,切割液的使用配比为TFA:EDT:TIS:水=95:2:2:1,切割3 h。获得的粗肽经MS检测的分子量为1357.00,纯化后纯度为95.124%,达到了理想的纯度要求,可用于后续实验。(3)在0～5.12μg/ml范围内,G8对L929细胞没有毒性作用,并且CCK-8结果显示,G8在50 ng/ml开始就显示出对FGF-2诱导的L929细胞增殖的抑制作用,同时G8显著抑制FGF-2诱导的H1299细胞FGFR2的磷酸化,表明固相合成的靶向FGF-2结合肽G8具有良好拮抗FGF-2的生物活性。(4)体内试验,构建博来霉素诱导的SD大鼠肺纤维化模型,治疗组大鼠肺组织苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、Masson染色、免疫组化(Immunhistochemistry,IHC)与模型组相比,肺结构较完善,胶原蛋白和FGF-2明显减少,结果都表明G8对肺纤维化有明显的抑制作用,验证了FGF-2参与肺纤维化的发展。结论筛选的靶向FGF-2的小分子肽G8,与FGF-2具有显著的结合特异性;G8对L929细胞没有细胞毒性,G8明显抑制FGF-2诱导的L929细胞的增殖;合成的G8下调了FGF-2诱导的H1299细胞的FGFR2磷酸化,具有良好拮抗FGF-2的生物活性;动物模型结果表明G8能抑制肺纤维化的发展,具有潜在的良好的治疗效果。