新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zhuhao0000
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新疆南疆地区具有适宜红枣生长的地理和气候条件,红枣种植面积和产量常年稳居世界首位。新疆红枣富含三萜烯酸类、黄酮类、碱基、核苷和环核苷酸类等多种功能因子,具有抗氧化应激、抗癌、抗炎症、免疫调节,以及胃肠道保护等多种生理功能。苯并芘(Ba P)广泛存在于空气、水、土壤、食品及其包装材料中,具有强烈的致癌性、致突变性和间接致畸性。Ba P通过食物、饮水、呼吸系统等途径进入人体,刺激机体产生大量的自由基而导致细胞氧化应激。氧化应激会诱发基因突变、蛋白质变性、线粒体功能障碍及脂质过氧化等损伤,是人体衰老、肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病和糖尿病的主要风险因子。因此,挖掘对抗Ba P危害的红枣功能因子,并深入探明其调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的分子机制,对以红枣为原料的新型功能性食品的创制具有重要的科学意义。本文主要研究内容及结果如下:(1)新疆红枣功能因子鉴定及多元统计分析以新疆99个品种红枣为研究对象,采用高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)对红枣中主要功能因子(黄酮类、三萜烯酸类、碱基、核苷和环核苷酸类化合物等)进行定性定量研究。结果表明:新疆不同品种红枣中总三萜烯酸含量范围为1082.775±63.431–7915.451±510.824μg/g DW,其中京39枣(C41)含量最高;白桦脂酸、麦珠子酸、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酮酸和2α-羟基熊果酸是新疆红枣中主要的三萜烯酸;总核酸类含量范围为408.329±8.611–1030.450±24.634μg/g DW,其中骏枣变种2号(C45)含量最高;尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤是新疆红枣中主要的核酸类物质;黄酮类含量范围为102.886±3.581–571.678±18.653μg/g DW,其中观音枣(C23)含量最高;儿茶素、表儿茶素、对香豆酸、芦丁、牡荆素、异牧荆素、阿魏酸、槲皮素3-O-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮苷、槲皮甙、二氢山萘酚、杨梅黄酮、圣草酚和白杨素是新疆红枣中的主要黄酮类物质。(2)基于细胞氧化损伤模型的红枣功能因子筛选首先建立了Ba P诱导的人肺部细胞氧化损伤模型;进一步基于该模型筛选红枣中对细胞氧化损伤具有最佳调控作用的功能因子及其干预方式。结果表明,以Ba P为诱导试剂,诱导浓度为400μmol/L,诱导时间为48 h条件下建立的细胞氧化损伤模型,可用于后续实验。与其他处理组相比,熊果酸(UA)干预可显著提高损伤模型细胞增殖活性和抗氧化酶活性(SOD、CAT、GSH),同时降低细胞内丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量(P<0.05)。以选择对细胞正常生长影响较小,且相对较高的浓度水平为原则下,筛选得到UA为最佳功能因子,最佳干预浓度为10μg/m L,最佳干预时间为48 h。(3)熊果酸对苯并芘诱导的细胞氧化损伤的调控机制研究在上述功能因子筛选的基础上,以UA为最佳干预试剂,通过研究UA干预对细胞氧化损伤模型周期与凋亡、DNA损伤、自噬相关蛋白表达量的影响,以及激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测,探讨UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控机制。结果表明,与氧化损伤组相比,UA干预组G0/G1期细胞增加12.770%,S期减少13.162%,G2/M期减少49.864%(P<0.01),细胞凋亡率减少58.170%,8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)含量减少46.39%,说明UA能显著改善Ba P对细胞周期的阻滞作用和减少细胞凋亡比率,修复细胞DNA损伤。同时,损伤模型细胞经UA干预后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、ATG5、P62蛋白表达量与损伤模型组相比差异显著(P<0.05),说明UA干预能显著降低细胞过度自噬,从而有效保护细胞免受Ba P损伤。激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测进一步证实UA能显著降低Ba P诱导的细胞氧化损伤,其机制与抑制细胞过度自噬有关。(4)熊果酸调控苯并芘诱导的细胞氧化损伤的转录组学分析采用转录组测序技术结合生物信息学分析,研究UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控作用及其分子机制。结果表明,UA干预组与氧化损伤组相比,表达显著上调和下调基因分别为296和688个;差异表达基因富集到的GO条目的生物学过程主要是:细胞连接、细胞内受体信号通路、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号的调节;细胞组分主要是:核质、细胞核、细胞膜、细胞质;分子功能主要是:胰岛素样生长因子激活受体活性、蛋白酪氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、转录因子结合。差异表达基因KEGG pathway分析主要富集到NF-kappa B、Wnt、MAPK和m TOR信号通路。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)对主要差异表达基因atg2a,nfkb1,eif4ebp1,pik3ip1和nr4a1进行验证,结果表明UA调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的机制主要通过PI3k-AKT/m TOR信号通路上的eif4ebp1、nfkb1与nr4a1基因调控其上下游基因(mapkapk2、zfp36l1、il1a)的表达,从而缓解细胞过度自噬和细胞衰老进程,进而调控Ba P诱导的细胞氧化损伤。综上所述,本研究在新疆不同品种红枣中主要功能因子系统分析的基础上,通过Ba P诱导的细胞氧化损伤模型筛选出UA为最佳功能因子,并初步阐明了UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的保护作用及其分子机制。研究结果为新疆南疆红枣精深加工和利用提供了理论依据,对南疆红枣产业的持续健康发展和农民脱贫致富具有重要意义。
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