[研究背景]面瘫按其发生的部位可分为中枢性和周围性两大类,而面神经独特的解剖学结构则是造成周围型面瘫发病率高且难于治疗的重要原因。面神经从脑内发出后即进入内听道,走形于一个狭小的骨性管道内。在受到损伤因素刺激后,面神经发生炎症反应,出现水肿。但由于骨性管道的束缚,面神经发生炎症水肿后缺乏肿胀的空间,使面神经管内压力增高,进一步影响局部血运,加重神经损伤,形成“水肿—缺血—水肿”的恶性循环。在面瘫的发病过程中,水肿起着重要的作用,如何减轻面神经的水肿则成为面瘫治疗中的关键点。水通道蛋白(AQPs)是一类可以快速转运水分子的膜通道蛋白,在全身多个组织、器官上参与细胞膜内外的水代谢和水肿的形成。外周神经主要表达水通道蛋白1,即AQP1。本课题组的前期研究证实AQP1表达于小鼠面神经雪旺细胞的胞膜上,随后,在小鼠面神经离断伤模型上发现,面神经受损水肿后,AQP1的表达明显升高,且与水肿程度在时相上有一定的相关性,提示其可能参与细胞水肿的形成。在目前文献中,尚未发现可明确调节AQP1表达及功能的药物。乙酰唑胺(AZA)作为一种可能的AQP1抑制剂多有报道,但其具体作用尚存在一定争议。因此,本研究旨在明确乙酰唑胺对面神经雪旺细胞AQP1功能及表达的调节作用,并在小鼠面神经离断伤模型上探索乙酰唑胺对面神经水肿及AQP1表达的影响,以期为临床治疗面神经水肿提供一定的理论依据。[研究目的]1、在细胞水平探究乙酰唑胺对雪旺细胞AQP1的表达调节作用；2、通过渗透压力实验探究乙酰唑胺对雪旺细胞AQP1的功能调节作用；3、构建小鼠面神经离断模型,探究乙酰唑胺在面神经受损后对面神经AQP1表达及面神经水肿的影响,以期为临床上治疗面神经水肿提供新的思路。[研究方法]1、原代培养小鼠面神经雪旺细胞,确认其是否表达AQP1。(1)选取新生5天的Balb/e小鼠,切取其双侧面神经,采用胰酶消化,差速贴壁法提纯后进行原代培养。(2)用AQP1和S-100免疫荧光共标染色的方法鉴定培养的雪旺细胞,并验证其APQ1的表达。2、用MTT法检测乙酰唑胺对原代培养面神经雪旺细胞增殖作用的影响。3、行渗透压力试验测量雪旺细胞的水渗透系数(water permeability, Pf值),观察乙酰唑胺对雪旺细胞AQP1表达的调节作用。原代培养的雪旺细胞共分为3组。A组,原代培养的雪旺细胞,未加干预药物；B组,渗透压力测量前30min,加入10μM终浓度的乙酰唑胺；C组,渗透压力测量前30min,加入10μM终浓度的HgCl2。细胞在加入calcein-AM37℃避光孵育30min后,荧光剂进入活细胞。此时将细胞膜外的液体环境突然变为低渗,细胞外水分子进入细胞,荧光剂被稀释,利用激光共聚焦显微镜观察并记录细胞内荧光强度的变化,并计算细胞对水分子的通透性,即Pf值。而Pf值直接反映出乙酰唑胺对雪旺细胞AQP1功能的调节作用。4、在雪旺细胞培养液中分别加入0.1μM、1μM、10μM终浓度的乙酰唑胺,培养3天后进行RT-PCR和Western Blot检测,观察雪旺细胞AQP1分别在基因和蛋白水平上的表达变化情况,明确乙酰唑胺对AQP1表达的表达影响。5、选取5周龄,20-22g健康的Balb/c小鼠,构建面神经离断伤模型,观察面神经在面神经管内的走形,以及在给予乙酰唑胺干预后面神经水肿情况和AQP1的表达情况。(1)采取耳下切口,在耳廓软骨前完全离断面神经,构建面神经离断伤模型,实验组通过灌胃给予乙酰唑胺(40mg/Kg-d),对照组给予生理盐水(40mg/Kg-d)分别在面神经离断后1d、3d、5d、7d处死动物,切取面神经颅骨段,切取标本后行RT-PCR和Western Blot检测,观察药物对面神经AQP1的表达的影响。(2)同法构建小鼠面神经离断模型,实验组和对照组处理同上,分别在面神经离断后1d、3d、5d、7d后切取头颅标本,行4%多聚甲醛固定、10%中性EDTA浸泡脱钙、20%与30%蔗糖阶梯脱水后,进行冰冻切片,观察实验组和对照组中不同时间点面神经的水肿情况。[结果]1、在Balb/c小鼠的面神经原代培养的雪旺细胞上行AQP1和S-100免疫荧光共标染色后,荧光显微镜下可见二者均显色,存在于同一细胞中,证实雪旺细胞上明确表达AQP1。2、乙酰唑胺对雪旺细胞的增殖活力无明显影响。3、雪旺细胞渗透水通透性(Pf值)的测量结果显示,A组(对照组)灌流曲线呈典型的“Z”形,Pf值最大,对水的通透性最好；B组(10μM终浓度的乙酰唑胺孵育30min)灌流曲线仍呈典型的“z”形,细胞的Pf值较A组小。C组(10μM终浓度的HgCl2孵育30min)未见典型的“Z”灌流曲线,其Pf值明显较A组、B组为小,即Pf值：A组>B组>C组。4、在原代细胞培养的雪旺细胞内加入不同浓度乙酰唑胺共培养后,进行western和RT-PCR检测,结果显示在终浓度为0.1μM时,乙酰唑胺即能明显降低雪旺细胞AQP1基因及蛋白的表达,且在实验浓度范围内并无明显浓度依赖性的作用。5、对构建面神经离断伤模型的小鼠,每日灌胃给予乙酰唑胺(实验组)或生理盐水(对照组),分别于离断伤后第1、3、5、7天取材行Western Blot和RT-PCR检测。Western Blot结果显示实验组AQP1的表达在伤后3天低于对照组,在伤后7天高于对照组,伤后1、5天无明显区别。RT-PCR结果显示实验组AQP1的表达在伤后1、3天低于对照组,在伤后5、7天高于对照组。6、小鼠面神经在颅骨内走形：面神经自脑内穿出进入颅骨面神经管内,在距离颅骨入口及出口处不远转弯,形成“S”形。面神经走行在耳蜗段时与蜗水管静脉伴行,此处面神经管骨质不连续,继续向外至迷路段面神经管再次移行为完整的骨性管道包绕面神经。7、面神经离断后给予乙酰唑胺对神经水肿的影响：通过对面神经颞骨段冰冻切片的观察及测量,面神经在离断后第1天即出现明显的肿胀,第3天时达到高峰。小鼠面神经在离断后第3天,实验组比对照组神经肿胀程度较轻,但在离断后第1、5、7天时,面神经肿胀程度与是否给药无明显区别。[结论]1、在小鼠来源的原代培养雪旺细胞上,乙酰唑胺可明显抑制AQP1的表达。2、乙酰唑胺对雪旺细胞增殖无明显的抑制作用。3、在小鼠面神经来源的原代培养雪旺细胞上,乙酰唑胺可抑制AQP1的表达和功能。4、在面神经离断伤模型上,乙酰唑胺可降低小鼠的AQP1表达的峰值(伤后第3天),并降低面神经水肿峰值的程度(伤后第3天),但在恢复期乙酰唑胺对水肿的影响不明显。