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目的本研究以颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)大鼠动物模型为研究对象,通过以PI3K/AKT信号转导通路来研究电针介入治疗及治疗时间的不同对TBI大鼠的行为学、脑组织病理改变、脑神经细胞凋亡及水肿的影响,揭示电针治疗颅脑损伤的机理,以期发现电针介入治疗的最佳时间窗,为临床电针治疗TBI提供科学的实验依据。方法选用健康清洁级SD大鼠170只,利用随机数字表法将其分为空白组(10只)、假手术组(10只),模型组(60只,每个取材时间点10只)、电针治疗1组(60只,每个取材时间点10只)和电针治疗2组(30只,每个取材时间点10只)。使用电子颅脑损伤仪(electric Cortical Contusion Injury,eCCI)在大鼠颅脑左侧(冠状缝后3mm、矢状缝旁开2.5mm)开颅打击(速度:5.30m/s、深度:4.5mm、停留时间:400ms),制备TBI大鼠模型(空白组和假手术组不打击造模)。取大鼠“百会、关元”,右侧前肢“曲池、合谷”,右侧后肢“足三里、涌泉”,电针1组于造模后4小时介入电针治疗,电针2组于第7天介入电针治疗,两组治疗到第14天结束。通过以下几个方面来评价电针的治疗效应:(1)造模后24h、7d、14d、21d对TBI大鼠的神经功能、平衡功能、行走功能以及患侧前后肢肢体的回缩力进行评价。(2)造模后24h、72h、7d、10d、14d:(1)HE染色在光镜下观察脑组织病理改变情况;(2)原位末端标记法(TUNEL)检测脑神经细胞凋亡情况;(3)ELISA法检测TBI大鼠血清中NSE及脑组织中TNF-α、TIMP-1浓度的变化;(4)免疫组化检测脑组织中AKT、TNF-α、Caspase-3、ERK、AQP-4、TIMP-1、MMP-9的变化;(5)免疫荧光检测脑组织中AKT、TNF-α、Caspase-3、ERK、AQP-4、TIMP-1、的变化;(6)Western-blot检测脑组织中AKT、TNF-α、Caspase-3、ERK、MMP-9的变化;(7)荧光定量PCR检测脑组织中AKT mRNA、TNF-αmRNA、Caspase-3mRNA、ERK mRNA、AQP-4 mRNA、MMP-9 mRNA、A20 mRNA的变化;(8)原位杂交法检测脑组织中A20 mRNA的变化。结果(1)电针治疗对TBI大鼠神经功能、平衡功能、行走功能以及患侧前后肢肢体回缩力的影响:与造模前比较,造模后各组大鼠在24h有明显的差异(P<0.01)。电针治疗1组在术后24h、7d、14d、21d的治疗效果比模型组好(P<0.01),在14d、21d治疗效果比电针治疗2组好(P<0.05)。在21d,电针治疗1组治疗效果与造模前接近,比较无统计学意义(P>0.05)。电针治疗2组在14d、21d治疗效果比模型组好(P<0.05)。(2)损伤脑组织病理学变化显示:空白组和假手术组脑组织结构完整,脑神经细胞形态正常。电针治疗1组脑组织炎症、水肿等在术后24h、72h、7d、10d、14d的改变比模型组好;电针治2疗组在术后10d、14d脑组织炎症、水肿等病理学的改变比模型组好术后,比电针治疗1组差。(3)血清中NSE含量的变化:术后24h模型组、电针治疗1组血清中NSE浓度明显升高,在72h达到最高,在第7d、10d呈现下降的趋势;14d电针治疗1组与空白组和假手术组比较无统计学意义(P>0.05)。电针治疗1组在第10d、14d血清中NSE浓度比电针治疗2组低(P<0.01),在24h、72h、7d、10d、14d比模型组低(P<0.01)。电针治疗2组第10d、14d血清中NSE浓度比模型组低(P<0.01)。(4)脑神经细胞凋亡的变化:模型组、电针治疗1组、电针治疗2组在术后24h、72h、7d、10d脑神经细胞凋亡的情况均比假手术组和空白组高(P<0.01)。模型组比电针治疗1组高(P<0.01),两组在术后24h细胞凋亡明显增多,在72h达到最多,在第7d、10d呈现下降的趋势。电针治疗2组在10d、14d细胞凋亡比电针治疗1组高(P<0.01),比模型组低(P<0.01)。14d电针治疗1组与空白组和假手术组比较无统计学意义(P>0.05),与模型组、电针治疗2组比较有统计学意义(P<0.01)。(5)PI3K/AKT通路相关蛋白TNF-α、AKT、Caspase-3、ERK及其mRNA的变化:与空白组和假手术组比较,模型组损伤脑组织中TNF-α、Caspase-3、ERK及其mRNA表达量在术后均升高(P<0.05),在72h达到最高;AKT及其mRNA表达量在术后下降(P<0.05),在72h达到最低。电针治疗1组与电针治疗2组损伤脑组织中TNF-α、Caspase-3、ERK及其mRNA表达量在术后均下降(P<0.05),电针治疗1组在第7d下降到最低;AKT及其mRNA表达量在术后上升(P<0.05),电针治疗1组在第7d上升到最高。(6)脑水肿相关蛋白AQP-4、TIMP-1、MMP-9及其mRNA以及抑制细胞凋亡A20 mRNA的变化:与空白组和假手术组比较,模型组损伤脑组织中MMP-9及其mRNA表达量在术后均升高(P<0.05),在72h达到最高;AQP-4、TIMP-1及其mRNA以及A20 mRNA表达量在术后均下降(P<0.05),TIMP-1、A20 mRNA在72h达到最低,AQP-4在第7d下降到最低;电针治疗1组与电针治疗2组损伤脑组织中MMP-9及其mRNA表达量在术后均下降(P<0.05),电针治疗1组在第7d下降到最低,AQP-4、TIMP-1及其mRNA以及A20 mRNA表达量在术后上升(P<0.05),电针治疗1组TIMP-1、A20 mRNA在第7d上升到最高,AQP-4在第72h上升到最高。结论(1)电针能有效改善颅脑损伤大鼠神经功能、平衡功能、行走功能、大鼠右侧前后肢肢体回缩力,减轻损伤脑组织出血、水肿、炎症,降低血清中NSE的浓度,抑制脑细胞凋亡,促进大脑功能的恢复。(2)电针能明显减少颅脑损伤大鼠脑组织中与炎症、细胞凋亡有关的TNF-α、Caspase-3、ERK蛋白及mRNA的表达量,增加与细胞存活、增值分化有关的AKT蛋白及mRNA的表达量,且电针介入治疗的时间越早,效果越好。(3)电针能明显抑制引起颅脑损伤大鼠脑水肿蛋白MMP-9及mRNA的表达量,增加消除脑细胞水肿、减轻炎症,并与细胞存活有关的AQP-4、TIMP-1蛋白及其mRNA以及抑制细胞凋亡的A20 mRNA的表达量。实验研究显示:早期电针介入对脑水肿及细胞凋亡的预防效果更显著。