能量稳态（Energy homeostasis）是动物生长发育过程中能量摄入、储存和消耗的动态平衡过程,是维持动物生长发育的基础。提高动物能量正平衡不仅可以提高饲料利用率和生产效率,还可以降低饲养成本、减少排泄,因此能量稳态的调节对畜禽生产具有重要意义。能量稳态主要受神经系统和内分泌系统调节。下丘脑弓状核Ag RP神经元通过感受机体营养水平,在调节动物能量摄入的同时还可以改变机体代谢率,而胰岛素调控的葡萄糖稳态不仅能够影响机体代谢过程中能量的产生、骨骼肌等组织营养物质的沉积,还可以抑制中枢对能量的摄入。肝素是一种存在于细胞外基质和循环血液中的糖胺聚糖,主要由肥大细胞和嗜碱性粒细胞分泌,具有抗凝血作用并参与机体的免疫调节。本研究首次发现:肝素对动物的采食和葡萄糖稳态具有重要的调节作用。第一部分:肝素促进动物采食的中枢机制试验以小鼠为研究对象,首先在不同能量状态下,检测血清肝素含量,结果发现饥饿24 h或者60%能量限饲一周都可显著提高血清肝素含量。急性注射肝素可显著提高动物采食量,而长期注射肝素发现,肝素不仅可以显著促进采食,还可以增加体增重,提高饲料利用率,并降低机体产热。进一步通过对NPY-GFP小鼠下丘脑c-fos染色以及Ag RP-td Tomato小鼠Ag RP神经元膜片钳检测发现,肝素可显著促进下丘脑Ag RP神经元活性;Western Blot,q PCR和Ch IP等检测发现肝素可能通过激活Fox O1,从而显著促进Ag RP神经元中神经递质的表达和分泌。而使用药物遗传学方法特异性激活或抑制Ag RP神经元,或使用Ag RP抗体封闭后,均能阻断肝素的促采食作用。由此证明,肝素主要通过激活下丘脑Ag RP神经元提高小鼠采食量。第二部分:肝素促进Ag RP神经元兴奋性的分子机制试验以N38细胞为研究对象,发现肝素可激活N38细胞炎症通路,并抑制胰岛素通路。但进一步使用炎症通路蛋白阻断或激动剂与肝素共处理后,未能有效阻断肝素促进Ag RP的表达和分泌的效应。采用琼脂糖凝胶层析分析发现,肝素可直接与Ag RP神经元上的胰岛素受体结合。同时,N38细胞胰岛素与胰岛素受体Co-IP以及免疫细胞化学结果均证实:肝素可直接抑制胰岛素与Ag RP神经元上的胰岛素受体结合。而高剂量胰岛素可有效抑制肝素对Ag RP神经元c-fos表达、Ag RP启动子活性以及促进采食的效应。Western Blot,Ch IP以及下丘脑弓状核和N38细胞免疫荧光结果也发现,肝素显著抑制Fox O1磷酸化,促进Fox O1向细胞核转位,进而结合Ag RP启动子并激活Ag RP表达。Fox O1阻断剂则可以逆转肝素对Ag RP启动子活性,Ag RP表达和采食的作用。说明肝素通过阻断胰岛素与Ag RP神经元的胰岛素受体结合,抑制了胰岛素通路,同时促进了Fox O1向细胞核转位,从而提高了Ag PR表达和Ag PR神经元的兴奋性,最终引起采食量增加。第三部分:肝素对动物葡萄糖代谢和胰岛素受体敏感性的调节作用基于肝素对Ag PR神经元的作用机制研究结果,我们推测:肝素可能同样能够调节机体胰岛素敏感性,从而影响葡萄糖代谢。为验证此假设,试验首先检测了胰岛素敏感性不同的小鼠血清肝素含量。结果发现,肥胖或者糖尿病小鼠（ob/ob）小鼠血清肝素含量显著高于正常小鼠。长期腹腔注射肝素后,通过口服葡萄糖耐受试验（Oral Glucose Tolerance Test,OGTT）和胰岛素耐受试验（Insulin resistance test,ITT）均发现,肝素能显著抑制胰岛素敏感性。相反,给予ob/ob小鼠长期腹腔注射肝素酶,以降解内源性肝素后,可显著降低ob/ob小鼠体重,并缓解其糖尿病症状。此外,肝素对STZ诱导Ⅰ型糖尿病小鼠血糖则无影响。外源性添加胰岛素后能恢复Ⅰ型糖尿病小鼠血糖,而对肝素处理组则无此效应。最后,为深入揭示肝素调控的靶组织,试验采用荧光标记葡萄糖2-NBDG示踪葡萄糖摄取过程,研究发现肝素可显著抑制骨骼肌肉葡萄糖吸收,而对肝脏和脂肪组织影响不大。骨骼肌细胞系C2C12细胞也有类似效应。由此可见,肝素通过降低机体胰岛素敏感性,引起胰岛素抵抗和抑制骨骼肌葡萄糖吸收,从而导致血液葡萄糖升高。第四部分:肝素调节骨骼肌胰岛素敏感性的分子机制为了进一步明确肝素调控骨骼肌细胞胰岛素敏感性的信号通路,采用Western Blot检测C2C12细胞炎症和胰岛素信号通路,发现肝素能显著抑制细胞炎症通路和胰岛素通路。琼脂糖凝胶层析结果发现,肝素同样可以直接与胰岛素受体结合。随后,用293T细胞为模型,转染IR-GFP并稳定表达。FRET检测结果表明,肝素可显著抑制胰岛素（Cy3标记）与胰岛素受体结合。采用Co-IP也进一步证实肝素可以抑制活体肌组织中胰岛素和胰岛素受体的结合。细胞和活体试验均表明,高浓度胰岛素共处理均能抑制肝素的抑葡萄糖吸收效应。另外,293T细胞和小鼠肌肉免疫荧光检测,均发现肝素可显著抑制GLUT4转位,而添加胰岛素或持续激活Akt或转染GLUT4糖基化突变质粒N57-GLUT4-GFP质粒后,肝素则对GLUT4转位效应无影响。最后,在过表达GLUT4-GFP的293T细胞添加荧光标记的唾液酸,采用FRET检测GLUT4糖基化,结果发现肝素可通过降低GLUT4糖基化,从而抑制其向细胞膜转位,而GLUT4糖基化突变后则无此效应。因此,肝素通过阻断胰岛素与骨骼肌细胞的胰岛素受体结合,抑制胰岛素通路,降低GLUT4糖基化,进而抑制GLUT4向细胞膜转位,最终引起血糖升高和胰岛素抵抗。综上所述,本研究发现:肝素通过降低胰岛素与其受体结合,阻断胰岛素通路,一方面促进Ag RP神经元Fox O1向细胞核转位并结合Ag RP启动子,从而激活Ag RP兴奋性;另一方面抑制骨骼肌细胞GLUT4向细胞膜转位,降低葡萄糖吸收。最终导致动物采食和体增重增加,升高血糖,降低能量消耗,提高饲料利用率。