【摘 要】
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本论文通过基因工程的方法，把源于天然蛇毒的去整合素dendroaspin中的一段含RGD(Arg-Gly-Asp)功能序列的13肽(CFTPRGDMPGPYC)基因及改变此13肽两端的两个半胱氨酸为两个丝氨酸
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本论文通过基因工程的方法，把源于天然蛇毒的去整合素dendroaspin中的一段含RGD(Arg-Gly-Asp)功能序列的13肽(CFTPRGDMPGPYC)基因及改变此13肽两端的两个半胱氨酸为两个丝氨酸的13肽(SFTPRGDMPGPYS)基因分别插入到突变的无活性人胰岛素原[A6-A11Ser]-HPI分子的B27和A1位点之间的基因中，从而取代掉[A6-A11Ser]-HPI分子上的C肽基因，构建成两个能展示RGD功能序列的人源化胰岛素基因，再通过分子克隆技术把这两个基因连接到温度诱导型表达载体质粒pBV220上，在大肠杆菌DH5α中进行高效表达(表达产率约为13％)。表达产物以不溶的包含体形式存在，再经超声破菌、包含体裂解、等电点沉淀、二硫键还原重组、SephadexG-50分子筛层析及反相柱层析等一系列步骤最终获得两个突变体蛋白RGD-Cys-Ins和RGD-Ser-Ins，两者的不同之处在于后者新插入的13肽上缺少了一对二硫键，使得RGD-Ser-Ins蛋白中的RGD功能序列及其周边几个氨基酸所构成的局域构象比RGD-Cys-Ins的更为松散灵活，缺乏刚性。对这两个蛋白所进行的分子量测定(质谱法)和氨基酸组成分析结果与预想的理论值相吻合，SDS-PAGE和NATIVE-PAGE电泳图谱显示两个蛋白均为单一条带，证明利用我们的提取及纯化方法所得蛋白纯度很高。进一步对两个蛋白进行性质分析及活性测定后表明：两者与胰岛素受体的结合活性均不到[A6-A11Ser]-HPI的0.3％，说明其胰岛素的生物活性已基本丧失；而它们的免疫活性约是[A6-A11Ser]-HPI的25％，暗示它们在一定程度上保留了胰岛素的免疫原性。RGD-Cys-Ins和RGD-Ser-Ins对ADP诱导的血小板凝集的半数抑制浓度分别为3，11μM，而它们对BALB／c小鼠出血时间的延长作用也是RGD-Cys-Ins的活性高于RGD-Ser-Ins。由此看来对RGD功能序列进行必要的结构限制使其具有一定的刚性有利于RGD功能序列更好的发挥其抗凝活性。 为了探索RGD-Cys-Ins基因在治疗和预防血栓方面的可能性及可行性，我们构建了RGD-Cys-Ins的真核表达载体——pCMV-RGD-Ins。具体方法为首先在RGD-Cys-Ins基因的前端加上一段胰岛素的引导肽基因，再连接到真核表达载体pcDNA3.1上。利用直接向肌肉注射质粒同时配合使用电穿孔技术的方法将治疗基因转入到正常BALB／c小鼠的骨骼肌内，转基因后每隔10天检测小鼠出血时间、
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