论文部分内容阅读
杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,其基因组大小为80-180 kb,在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒区别于其他病毒的一个显著特征是病毒生活史中产生两种不同的病毒粒子形态:一种为包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV),在病毒经口感染过程中,ODV在宿主中肠强碱性环境下从包涵体内释放,感染中肠上皮细胞实现原发感染;另一种为出芽型病毒粒子(budded virus,BV),主要介导细胞与细胞之间的感染。两种类型病毒粒子都由多种结构蛋白组成,其中BV囊膜的结构较ODV简单,病毒结构蛋白通过相互之间的作用共同形成完整的病毒粒子,并且这些相互作用还具有除结构支撑以外的其他功能。本研究以家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)为研究对象,利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术对其BV病毒结构蛋白间的相互作用进行了分析和验证。为进一步探讨病毒囊膜与核衣壳等结构在病毒入侵细胞过程中的作用,构建了能够同时标记BV病毒囊膜和衣壳的重组双荧光病毒。利用序列截短突变的方式对BV最重要的囊膜融合蛋白GP64与相关蛋白间的互作进行了深入分析,阐明了其参与互作的关键结构域。主要结论如下:1、探明了 BV病毒粒子结构蛋白间的相互作用网络通过对27个主要BV结构蛋白进行酵母双杂交一对一筛选,发现了 57对蛋白相互作用,其中6对为自相互作用。进一步用免疫共沉淀技术验证了其中的10对相互作用。根据迄今为止关于杆状病毒蛋白互作的研究,发现VP39、FP和38K是杆状病毒蛋白互作网络中参与蛋白互作最多的三个关键蛋白,由此推测它们可能是病毒结构的主要骨架;还发现每种囊膜蛋白都与至少一个衣壳蛋白发生互作。根据这些蛋白互作信息,最终确立了 5组BV结构蛋白间的互作网络。这些结果对于深入理解杆状病毒的结构具有重要参考意义。2、成功构建了同时标记病毒囊膜和衣壳的双荧光重组病毒为进一步探究BV结构蛋白中病毒囊膜和衣壳蛋白间的互作以期揭示病毒囊膜及衣壳这两个结构在病毒感染细胞过程中的作用,构建了能够同时标记病毒囊膜及衣壳的双荧光病毒。利用“A-red同源重组系统”将BmNPV病毒本身的vp39和gp64基因双敲除,并在此基础上利用该重组系统将融合有3个红色荧光mCherry基因的vp39恢复到病毒基因组,再利用“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统”将融合有绿色荧光egfp的gp64转座到多角体启动子下游以恢复gp64。结果表明GP64融合EGFP和VP39融合3个mCherry一起成功整合到病毒基因组。其中,gp64C端融合egfp对病毒的产生没有影响,但N端融合egfp后病毒产量显著降低,表明gp64N端结构域对于其功能具有重要作用。该双荧光重组病毒可以用于单个病毒粒子的实时追踪和病毒结构的研究,也可以利用EGFP和mCherry标签抗体对荧光信号进行放大或是直接用于蛋白荧光共定位或亚细胞定位研究,为深入研究杆状病毒的动态感染过程和感染机制提供了一个有力工具。3、阐明了病毒主要囊膜融合蛋白GP64与主要衣壳蛋白VP39之间的互作特点GP64为BV病毒主要的特征性囊膜蛋白,VP39是主要的衣壳蛋白,它们两者均为病毒中含量最高的重要结构蛋白。因此,对GP64与VP39间的互作进行深入分析对理解病毒囊膜与衣壳间的关系具有重要意义。根据GP64功能域的划分构建一系列GP64截短突变体,通过酵母双杂交和Co-IP验证,鉴定了 GP64蛋白中1-78aa为与VP39互作的关键功能域。此外,通过免疫荧光观察GP64全长和截短突变体与VP39在细胞中的亚定位及共定位,发现全长GP64与VP39在感染后24 h和48 h共定位于细胞质和细胞膜,感染后72 h,GP64在细胞核膜形成环状结构,VP39逐渐进入细胞核,这暗示GP64可能参与VP39转运至细胞核;感染后48 h,GP64(1-523 aa)与VP39在细胞核膜上存在环状共定位,但随着GP64 N端保留不断减少,两者的共定位由细胞核膜转移至细胞质再转移至细胞膜,这表明VP39与GP64之间的互作对它们在细胞内定位具有重要影响。4、阐明了主要囊膜融合蛋白GP64与FP、PKIP、38K之间的互作特点鉴于VP39、FP和38K(均为衣壳蛋白)是病毒蛋白互作中的核心蛋白,而PKIP是与结构蛋白互作最多的结构相关蛋白,为深入探究这些蛋白间的互作关系,进一步对GP64与FP、PKIP、38K之间的互作特点进行了解析。将GP64各序列截短突变体分别与FP,PKIP和38K进行一对一酵母双杂交分析,发现GP64与这三个蛋白的关键互作结构域均位于其N端1-78 aa。荧光共定位分析发现,GP64仅保留N端1-78aa仍与PKIP和FP均存在共定位,这与酵母双杂交结果一致。GP64部分截短突变体与PKIP在感染后24 h的共定位发生在细胞核膜,这与GP64和VP39的共定位相似,暗示GP64可能参与将PKIP转运入细胞核。