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为了系统了解金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌在奶牛乳房炎疾病病原中的分布情况,本试验选择了广西壮族自治区6个规模化奶牛场,开展该三种菌的细菌分离与鉴定；并研究建立针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的奶牛乳房炎多重PCR检测方法。试验一：对广西壮族自治区6个规模化奶牛场采集的150份奶牛乳房炎奶样进行细菌分离鉴定,采用培养基鉴定、染色鉴定及生化试验鉴定等方法进行细菌学检测。试验结果表明：共检出22株金黄色葡萄球菌、34株大肠杆菌、6株蜡样芽孢杆菌,检出率分别为14.7%、22.7%、4.0%；与金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌相比,大肠杆菌在5个奶牛场的检出率均居首位,其总检出率也位居第一。62份被细菌感染的奶样中有48份为混合感染,混合感染率达77.4%。试验二：本试验针对金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌16S-23SrRNA基因和蜡样芽孢杆菌hblA基因,运用Primer5.0和Oligo7.0软件设计了3对特异性引物；采用正交试验探索和优化PCR反应体系及反应条件,从而建立金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的奶牛乳房炎多重PCR检测方法,并对50份临床奶样进行检测。多重PCR反应体系及反应条件优化结果表明：10×PCR Buffer2.5μL、 dNTPs (各2.5mmol/L)2.0μL, Mg2+(25mmol/L)1.5μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,金黄色葡萄球菌上下引物(50pmol/μL)各0.1μL、大肠杆菌上下引物(50pmol/μL)各0.3μL、蜡样芽孢杆菌上下引物(50pmol/μL)各0.5μL、混合模板3μL,加水至25μL。最佳退火温度56.8℃；最佳循环次数为35次；特异性试验结果表明：试验菌株均扩增出与引物设计一致的扩增产物片段,即金黄色葡萄球菌249bp、大肠杆菌375bp、蜡样芽孢杆菌499bp。而其他非阳性菌株未扩增出目的DNA片段。敏感性试验结果表明：该多重PCR检测方法对3种菌基因组DNA的最低同时检出量为10pg/μL。测序结果表明：对扩增产物片段进行克隆测序,将其测序结果与GeneBank中对应的基因序列进行同源性比对,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的同源性分别为100%、99%和99%。临床试验结果：对50份奶样同时进行细菌学检测和本试验建立的2个多重PCR检测,两者相比符合率为92%,就检出率而言,PCR检测方法高于细菌学检测方法。