[研究背景]ANGPTL7是新近发现的血管生成素样蛋白家族成员之一,目前对ANGPTL7的各种研究主要集中在调节血管生成方面,其可通过促进血管内皮细胞的增殖、迁移和分化来调节血管生成。此外,还有越来越多的研究揭示了ANGPTL7在造血干细胞和平滑肌细胞的增殖和分化中起着重要作用。最近又有研究发现骨组织存在一种新的毛细血管内皮细胞亚型,且认为骨质疏松的发生与血管形成具有相关性;那么,ANGPTL7是否可以通过调节成骨细胞增殖、分化从而影响骨形成,并对预防和治疗骨质疏松产生相关作用呢?本实验将围绕这一问题进行相关研究。第一部分ANGPTL7在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达研究目的:研究ANGPTL7在MC3T3-E1细胞成骨分化中的表达情况,为进一步研究ANGPTL7对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的作用提供实验依据。方法:采用成骨诱导分化培养基培养小鼠MC3T3-E1细胞,诱导其成骨分化。显微镜下观察诱导分化不同时间点细胞生长情况,分别采用RT-PCR和Western blot检测MC3T3-E1细胞中ANGPTL7的表达水平。结果:(1)镜下观察,诱导分化第0 d和第3 d时细胞贴壁生长,且表现为成纤维样生长,细胞形态较饱满,呈多角形或梭形;至第7 d时已基本长满,细胞明显变为细长的梭形,开始复层生长,有角状突起,并有团簇生长趋势;第14 d时细胞聚集成多个结节呈突起的多层结构,可见部分钙化结节形成。第7 d和第14 d细胞聚集和团块生长较第0 d和第3 d明显。(2)RT-PCR的结果表明在成骨诱导的MC3T3-E1细胞中,随着诱导时间延长,ANGPTL7 m RNA的表达量逐渐升高,在诱导第7 d时ANGPTL7 m RNA的表达量达到峰值,并持续高表达至第14 d,诱导第7 d和第14 d时ANGPTL7 m RNA表达量较诱导第0 d和第3 d时明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),Western blot检测结果与RT-PCR一致。结论:本研究发现MC3T3-E1细胞成骨诱导分化后生长良好,ANGPTL7在成骨培养基诱导的MC3T3-E1细胞中表达明显升高,且呈时间依赖性。第二部分ANGPTL7对MC3T3-E1细胞增殖和分化能力的影响目的:研究ANGPTL7对MC3T3-E1细胞增殖和分化能力的影响,为进一步探讨ANGPTL7对骨质疏松的影响提供实验基础。方法:以MC3T3-E1细胞为研究对象,分别将具有嘌呤霉素抗性的过表达ANGPTL7质粒p MSCV-ANGPTL7和阴性对照空质粒p MSCV转染MC3T3-E1细胞。设置如下分组:(1)空白对照组;(2)p MSCV阴性转染对照组;(3)p MSCV-ANGPTL7过表达转染组。转染48 h后,分别采用RT-PCR和Western blot检测ANGPTL7的表达水平,评估转染效率。采用CCK-8评价细胞增殖情况。分别采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测方法和茜素红染色方法检测ANGPTL7对成骨细胞分化和矿化能力的影响。最后采用Western blot检测成骨标志物ALP、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)以及I型胶原蛋白(Col I)的表达水平。结果:(1)将ANGPTL7过表达质粒p MSCV-ANGPTL7转染到MC3T3-E1细胞中。分别采用RT-PCR与Western blot检测,结果显示:转染p MSCV-ANGPTL7的MC3T3-E1细胞中,ANGPTL7 m RNA和蛋白表达水平和空白对照组以及阴性转染对照组相比均显著升高(P<0.05)。(2)转染48 h后进行CCK-8检测。结果显示:随着培养时间延长,三组细胞增殖能力均逐渐增加;在培养第24 h、48 h和72 h,ANGPTL7过表达组的细胞增殖能力均高于空白对照组及阴性转染对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(3)转染7 d后,采用ALP活性染色试剂盒检测ALP活性,结果显示:与空白对照组和阴性转染对照组相比,ANGPTL7过表达组染色阳性细胞数明显增多(P<0.05),提示ALP活性显著提高。采用Western blot检测成骨细胞分化标记蛋白ALP、Runx2、OCN、Col I的表达水平。结果表明,ANGPTL7过表达组显著增加了ALP、Runx2、OCN和Col I的表达(P<0.05)。(4)转染21 d后,用茜素红染色法测定ANGPTL7对细胞矿化的影响。与空白对照组和阴性转染对照组相比,转染p MSCV-ANGPTL7的MC3T3-E1细胞中钙沉积量明显增加。结果表明ANGPTL7过表达组细胞的矿化骨生成活性明显高于对照组和阴性转染对照组(P<0.05)。结论:将ANGPTL7过表达质粒p MSCV-ANGPTL7转染到MC3T3-E1细胞中后,ANGPTL7表达水平显著升高,表明转染成功。ANGPTL7基因过表达转染MC3T3-E1细胞后,明显促进了细胞的增殖能力;同时显著增加了ALP、Runx2、OCN和Col I等成骨分化标记物的表达以及矿化骨结节的形成,这些均是成骨细胞分化和矿化成熟的重要标志。第三部分BMP信号通路在ANGPTL7促进MC3T3-E1细胞增殖、分化中的作用目的:探讨ANGPTL7促进MC3T3-E1细胞增殖、分化的作用机制,为进一步研究ANGPTL7用于骨质疏松的预防和治疗提供理论依据。方法:(1)以MC3T3-E1细胞为研究对象,仍采用第二部分实验分组:(1)空白对照组;(2)p MSCV阴性转染对照组;(3)p MSCV-ANGPTL7过表达转染组。采用Western blot检测BMP信号通路中BMP蛋白的表达水平。(2)为了进一步研究BMP信号通路在ANGPTL7促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化中的作用机制,本研究加入了BMP信号通路抑制剂LDN-193189,并重新设置如下分组:(1)空白对照组;(2)ANGPTL7过表达组(Angptl7组);(3)ANGPTL7过表达+LDN-193189组(Angptl7+抑制剂)。分别予以成骨诱导分化,两周后用ALP染色和茜素红染色方法对各组样本进行染色,检测ALP活性和细胞矿化能力;最后采用Western blot检测三组成骨标志物ALP、Runx2、OCN、Col I的蛋白表达水平。结果:(1)转染7 d后,采用Western blot检测BMP信号通路中BMP蛋白的表达水平,结果显示:ANGPTL7过表达组BMP2、4、6、7蛋白的表达水平较空白对照组和阴性转染对照组显著提高(P<0.05),其中以BMP2、7的表达水平提高最为显著。结果表明ANGPTL7可以显著促进MC3T3-E1细胞BMP蛋白的表达。(2)利用ALP染色检测三组细胞成骨分化能力。结果显示:Angptl7组的染色阳性细胞数较空白对照组和Angptl7+抑制剂组明显增多(P<0.05),提示Angptl7+抑制剂组细胞成骨分化能力较Angptl7组明显减弱。(3)转染并诱导分化21 d后,用茜素红染色测定三组细胞矿化能力的影响。结果显示:与空白对照组相比,ANGPTL7过表达组的MC3T3-E1细胞中钙沉积量明显增加(P<0.05);在添加BMP信号通路抑制剂LDN-193189后,Angptl7+抑制剂组钙结节染色数量及深度较过表达组均显著降低(P<0.05)。(4)利用Western blot检测三组中成骨细胞分化相关蛋白的表达情况,结果显示:与空白对照组相比,Angptl7组中成骨分化相关标记物ALP、Col I、OCN、Runx2表达水平显著增加(P<0.05);添加BMP信号通路抑制剂后,Angptl7+抑制剂组成骨分化相关标记物ALP、Col I、OCN、Runx2表达水平较空白对照组和Angptl7组显著降低(P<0.05)。结论:ANGPTL7主要作用机制是通过激活BMP信号通路的表达来促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化。