阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种广谱的肿瘤化疗药物,广泛用于乳腺癌、血液系统肿瘤和消化道肿瘤等多种恶性肿瘤的化疗,然而,由于阿霉素并非特异性地作用于肿瘤细胞,故在抑制肿瘤的同时也可以对正常的组织细胞产生一定程度的抑制作用,即阿霉素的毒副作用。在阿霉素毒副作用中,心脏毒性最为明显,因而也是研究的热点。目前的研究多集中于阿霉素对心肌细胞的毒性作用,然而,阿霉素对非心肌细胞如血管内皮细胞功能影响的研究比较少。心肌微小血管稳态尤其是心肌微小血管的内皮细胞对心肌细胞功能具有重要作用,阿霉素对血管内皮细胞及血管稳态的影响可能参与了阿霉素相关的心肌细胞毒性作用。有研究显示血管内皮生长因子VEGFA在维持血管结构和功能中起着非常重要的作用,而阿霉素能够抑制VEGFA的表达,本研究组在预实验中应用基因芯片筛查出高表达的miR-526b-3p,同时发现高表达的miR-526b-3p对小鼠心脏功能以及微血管具有损伤作用。本研究旨在探讨miR-526b-3p在阿霉素诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及机制,为预防和治疗阿霉素相关的心脏毒性提供新靶点和新方法。第一部分 miR-526b-3p在阿霉素引起的微血管和心脏功能损伤中的作用目的:研究阿霉素对miR-526b-3p表达的影响及对小鼠微血管和心脏功能的损伤作用;进一步研究高表达miR-526b-3p对阿霉素诱导的小鼠心脏功能、微小血管损伤作用的影响。方法:1.将10只C57BL/6雌性小鼠按阿霉素干预与否分为对照组和阿霉素组(DOX组),阿霉素组给予阿霉素(DOX)25mg/kg一次性腹腔注射,对照组则给予等量的生理盐水。2周后进行心脏超声测定左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(FS);采用免疫组化检测心肌组织CD31/CD34水平;基因芯片技术检测miRNA的表达水平。2.将40只C57BL/6雌性小鼠按照处理方法分为对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组。rAAV为重组的腺相关病毒载体。各组详细情况见正文。经尾静脉注射腺相关病毒载体1μL、1×1011滴腺相关病毒转染小鼠,2周后,应用qrt-PCR法检测miR-526b-3p的表达情况,确认转染效果。转染成功后,除对照组外的所有组给予一次性腹腔注射阿霉素(DOX)25mg/kg。2周后对对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP组和DOX+rAAV-miR-526b-3p组小鼠进行心脏超声检测左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(FS)以评估miR-526b-3p对心脏功能的影响;采用免疫组化法检测各组小鼠心肌组织CD31/CD34的水平以评估血管密度情况。结果:1、基因芯片检测结果显示,阿霉素组小鼠心肌组织中miR-526b-3p的表达水平显著升高(分别为4.94±0.49和1.00±0.12,p<0.01)。免疫组化染色实验检测结果显示,血管密度标志蛋白CD31和CD34的水平降低,DOX组的心肌组织CD31的免疫组织化学染色阳性低于对照组(分别为0.65±0.09和1.00±0.16,p<0.01);DOX组心肌组织CD34的免疫组织化学染色阳性亦显著低于对照组(分别为0.63±0.09和1.00±0.10,p<0.01)。2、在阿霉素小鼠采用腺病毒转染形成过表达miR-526b-3p、抑制表达miR-526b-3p以及表达突变的miR-526b-3p,确认转染效果,结果显示对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组的 miR-526b-3p 相对表达水平分别为 1.00±0.11、4.26±0.53、4.54±0.11、9.72±1.39、1.26±0.19 和 4.08±0.68。与 DOX+rAAV-GFP组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 miR-526b-3p 表达量明显增高(p<0.01);与DOX+rAAV-miR-526b-3p 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组的 miR-526b-3p表达量明显下降(p<0.01);DOX组与DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组之间无显著差别(p>0.05),说明小鼠实验模型建立成功。3、检测miR-526b-3p对心脏微血管标记物CD31/CD34的影响,对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p 组、DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组 CD31 相对水平分别为 1.00±0.15、0.69±0.10、0.73±0.11、0.45±0.07、0.85±0.10 和 0.59±0.06。与DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3P 组 CD31 水平显著降低(p<0.01);与 DOX+rAAV-miR-526b-3P组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs 组 CD31 水平升高(p<0.01);DOX 组与DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut组之间无显著性差异(p>0.05);以上六组CD34相对水平分别为 1.00±0.14、0.70±0.08、0.56±0.07、0.41±0.43、0.82±0.12 和 0.59±0.07。与DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3P 组 CD34 水平显著降低(p<0.01);与 DOX+rAAV-miR-526b-3P 组比,DOX+rAAV-miR-526b-3p+TuDs 组 CD34 水平显著升高(p<0.01);DOX 组与 DOX+rAAV-miR-526b-3p-mut 组之间无显著性差异(p>0.05),表明DOX使miR-526b-3p表达水平升高,而miR-526b-3p表达升高减少了小鼠心肌组织中微血管密度和数量。4、检测miR-526b-3p对小鼠心脏FS、LVEF的影响,对照组、DOX组、DOX+rAAV-GFP 组和 DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 LVEF 分别为(78.03±14.84)%、(5 7.12±14.58)%、(56.06±18.86)%和(20.18±4.25)%。与对照组相比,DOX 组的 LVEF 显著下降(p<0.01);与 DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p组的 LVEF 显著下降(p<0.01);以上四组的 FS 分别为(54.27±5.48)%、(28.75±3.83)%、(26.65±4.25)%和(11.80±2.67)%。与对照组相比,DOX 组的 FS 显著下降(p<0.01);与 DOX+rAAV-GFP 组相比,DOX+rAAV-miR-526b-3p 组的 FS 显著下降(p<0.01),结果表明高表达miR-526b-3p损害心脏功能。结论:阿霉素使小鼠心脏miR-526b-3p的表达水平增高、血管内皮标志物CD31和CD34的阳性率降低、小鼠的心脏功能指标LVEF和FS降低;高表达miR-526b-3p加重了阿霉素对心肌微小血管和心脏功能的损害作用,抑制miR-526b-3p表达则能减弱上述损害作用,表明miR-526b-3p参与了阿霉素引起的心肌血管和心脏功能的损伤作用。第二部分 MiR-526b-3p在阿霉素引起的HUVEC损伤中的作用目的:探讨MiR-526b-3p在阿霉素引起的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤中的作用。方法:采用 MiR-526b-3p 类似物(MiR-526b-3p mimic)及 MiR-526b-3p 抑制剂(miR-526b-3p inhibitor)以及相应的阴性对照物(NC mimics、NC inhibitor)分别转染HUVEC 36小时后加阿霉素处理。根据处理因素分为对照组、DOX组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor组。其中对照组和阿霉素组不转染核酸。各组详细情况见正文。各组中miRNA相关制剂5 μL,阿霉素5μM。阿霉素处理12小时后,应用RT-PCR方法测定各组miR-526b-3p的相对表达量,确认转染效果;后采用EDU方法检测血管内皮细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,Matrigel基质胶评估成管能力,transwell小室方法评估细胞迁移能力。结果:1、确认转染效果:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的 miR-526b-3p 相对表达量分别为 1.00±0.11、5.61±0.85、5.13±0.78、10.53±1.20、4.77±0.53 和 1.82±0.26。与对照组比较,DOX组的miR-526b-3p表达水平显著上调(p<0.01);与DOX+NC mimics组比较,DOX+miR-526b-3p mimics组的miR-526b-3p表达水平显著上调(p<0.01);与 DOX+NC inhibitor 组比较,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的miR-526b-3p表达水平显著下降(p<0.01)。2、增殖方面:各组值分别为 62.00±6.24、25.67±4.73、29.33±3.51、12.33±3.51、26.87±5.06和54.33±3.51。对比对照组,DOX组的EdU活性显著下降(p<0.01);对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics 组的 EdU 活性显著下降(p<0.01);对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的 EdU 活性显著上升(p<0.01)。3、细胞凋亡:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的相对值分别为 1.03±0.06、2.95±0.19、3.14±0.26、4.95±0.30、2.95±0.25 和 1.50±0.42。与 control 组比,DOX组的细胞凋亡水平显著升高(p<0.01);与NC mimc组相比,miR-526b-3p mimc组的细胞凋亡水平显著升高(p<0.01);与NC inhibitor组相比,miR-526b-3p inhibitor组的细胞凋亡水平显著下降(p<0.01)。4、成管能力:对照组、DOX 组、DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+NC inhibitor 组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的相对值分别为 0.99±0.01、0.25±0.11、0.28±0.11、0.10±0.02、0.31±0.06 和 0.92±0.02。对比对照组,DOX 组的小管形成能力显著下降(p<0.01);对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics组的小管形成能力显著下降(p<0.01);对比DOX+NC inhibitor组,DOX+miR-526b-3p inhibitor组的小管形成能力显著上升(p<0.01)。5、细胞迁移能力:对照组、DOX组、DOX+NC mimics组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+NC inhibito组和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的迁移能力相对值分别为 0.99±0.01、0.32±0.04、0.35±0.03、0.09±0.03、0.29±0.04和0.89±0.04。对比对照组,DOX组的细胞迁移能力显著下降(p<0.01);对比DOX+NC mimics组,DOX+miR-526b-3p mimics组的细胞迁移能力显著下降(p<0.01);对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor 组的细胞迁移能力显著上升(p<0.01)。结论:阿霉素使miR-526b-3p表达上调,而高表达miR-526b-3p加剧了阿霉素对脐静脉内皮细胞的损害包括抑制脐静脉内皮细胞的增殖活性、促凋亡、抑制成管能力和抑制迁移能力等,因此,阿霉素引起的脐静脉内皮细胞损伤极有可能是通过上调miR-526b-3p的表达实现的,即miR-526b-3p参与了阿霉素引起的血管内皮细胞的损伤。第三部分 VEGFA在miR-526b-3p引起的HUVEC损伤中的作用目的:探讨VEGFA是否能够减弱miR-526b-3p对HUVEC的损伤作用。方法:1.探索阿霉素对VEGFA表达的影响时分为对照组(control)和DOX组。对照组不给与任何干预,DOX组给与终浓度为5 μM的阿霉素处理。2.构建高表达VEGFA 的 pcDNA3.1-VEGFA 质粒、空白的pcDNA 质粒,应用 miR-526b-3p mimics/NC mimics进行分组转染HUVEC,探索VEGFA对细胞的影响时分为DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA组和DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组。各组详细情况见正文。相关pcDNA剂量为2μg,相关miRNA剂量为5μL,阿霉素终浓度为5μM。转染36小时后加阿霉素处理12小时,对转染了 pcDNA质粒的各组细胞采用RT-PCR检测各组VEGFA mRNA的相对表达量以确认转染效果,采用EDU方法检测血管内皮细胞的增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、Matrigel基质胶评估成管能力和transwell小室方法评估细胞迁移能力。结果:1、DOX对VEGFA的表达影响:对照组和DOX组的VEGFA mRNA表达水平分别为1.00±0.13和0.38±0.04,组间差异有统计学意义(p<0.01),表明DOX抑制VEGFAmRNA 的表达。2、VEGFA 对细胞活性的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组 和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞活性值分别为 30.30±2.36、14.17±3.01、30.83±3.55、66.00±4.58 和 23.17±3.01。DOX+miR-526b-3p mimics 组的 EdU 活性显著低于 DOX+NC mimics 组(p<0.01);DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的 EdU 活性显著高于 DOX+miR-526b-3p mimics 组(p<0.01);DOX+pcDNA-VEGFA 组的 EdU 活性显著高于DOX+pcDNA组(p<0.01),说明VEGFA促进细胞的活性。3、VEGFA 对细胞凋亡的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组 和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡相对值分别为 0.98±0.02、2.19±0.18、1.01±0.02、0.38±0.06 和 1.12±0.13。DOX+miR-526b-3p mimics 组的细胞凋亡水平显著高于DOX+NC mimics 组(p<0.01);DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡水平显著低于 DOX+miR-526b-3p mimics 组(p<0.01);DOX+pcDNA-VEGFA 组的细胞凋亡水平显著低于DOX+pcDNA组(p<0.01),说明VEGFA减弱细胞的凋亡。4、VEGFA 对细胞成管能力的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组的小管形成能力相对值分别为0.99±0.01、0.30±0.04、1.01±0.02、2.62±0.13 和 1.18±0.20。DOX+miR-526b-3p mimics 组的小管形成能力显著低于 DOX+NC mimics 组(p<0.01);DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的小管形成能力显著低于 DOX+miR-526b-3p mimics 组(p<0.01);DOX+pcDNA-VEGFA组的小管形成能力显著高于DOX+pcDNA组(p<0.01)。说明VEGFA促进细胞的成管能力。5、VEGFA 对细胞迁移能力的影响:DOX+NC mimics 组、DOX+miR-526b-3p mimics 组、DOX+pcDNA 组、DOX+pcDNA-VEGFA 组和 DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA组的细胞迁移能力相对值分别为0.99±0.01、0.35±0.02、0.10±0.01、2.05±0.08 和 0.84±0.05。DOX+miR-526b-3p mimics 组的细胞迁移能力显著低于 DOX+NC mimics 组(p<0.01);DOX+miR-526b-3p mimics+pcDNA-VEGFA 组的细胞迁移能力显著高于DOX+miR-526b-3p mimics组(p<0.01);DOX+pcDNA-VEGFA组的细胞迁移能力显著高于DOX+pcDNA组(p<0.01)。说明VEGFA促进细胞的迁移能力。结论:阿霉素可降低VEGFA mRNA的表达,低表达的VEGFA加重miR-526b-3p介导的阿霉素对血管内皮细胞的损害作用;引入VEGFA则能减弱miR-526b-3p介导的阿霉素对血管内皮细胞的损害作用,引入VEGFA有望成为改善阿霉素心脏毒性患者的心脏功能的一种新的治疗方法。第四部分 MiR-526b-3p对VEGFA调控作用的机制研究目的:探讨MiR-526b-3p对VEGFA的调控机制。方法:1、探索miR-526b-3p对VEGFA的调控时转染分组分为DOX+NC mimics组(简称 NC mimics 组)、DOX+miR-526b-3p mimics 组(简称 miR-526b-3p mimics 组)、DOX+NC inhibitor 组(简称 NC inhibitor 组)和 DOX+miR-526b-3p inhibitor 转染组(简称miR-526b-3p inhibitor组)。各组详细情况见正文。miRNA制剂5μL,转染36 h后加入终浓度为5 uM的阿霉素,处理12小时。应用RT-PCR法检测各组VEGFA mRNA的表达情况。2、构建含VEGFA3’UTR区序列的pcDNA-EGFP-VEGFA载体,按照实验分为NC mimics+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组,miR-526b-3p mimics+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组,NC inhibitor+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA 组和 miR-526b-3p inhibitor+pcDNA3.1-EGFP-VEGFA组。各组详细情况见正文。转染时,相关载体0.5μg,相关miR制剂0.25uL,转染24小时后加终浓度为5 μM的阿霉素处理12小时,随后检测GFP强度,组间进行相对荧光强度比较以探索miR-526b-3p与VEGFA3’UTR是否结合。3、构建含VEGFA启动子区序列的PGL3载体,按实验需要分为pGL3-VEGFA+PRL-SV40+NC mimics 组、pGL3-VEGFA+PRL-SV40+miR-526b-3p mimics组、pGL3-VEGFA+PRL-SV40+NC inhibitor 组 和pGL3-VEGFA+PRL-SV40+miR-526b-3p inhibitor 组。pGL3 质粒是一个将含 VEGFA启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒。PRL-SV40为海肾荧光素酶报告基因载体,作为荧光素酶报告基因的内参对照。各组详细情况见正文。转染时,相关载体0.5 μg,相关miR制剂0.25 μ L,转染24小时后加5 μ M的阿霉素处理24小时,随后检测荧光素酶活性强度以探索miR-526-3p与VEGFA启动子是否有结合。4、JASPAR网页查询STAT3在VEGFA启动子上的结合位点;生物信息学软件Starbase2.0查找STAT3与miR-526b-3p之间结合的潜在靶点序列。5、研究STAT3对VEGFA的调控作用时转染分组为si-NC组、si-STAT3#1组、si-STAT3#2 组、pcDNA3.1 组和 pcDNA3.1/STAT3 组。其中,si-NC 组为阴性对照,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组为STAT3不同序列位点的小核苷酸干扰物,pcDNA3.1组为不表达STAT3的空载的载体,pcDNA3.1/STAT3组为高表达STAT3的载体。其中,小干扰RNA转染终浓度为100nM,体积为10 uL;质粒DNA转染量为4μg每孔,以上各组转染36小时后加5 μ M的阿霉素处理12小时,应用RT-PCR法检测各组VEGFA mRNA的表达情况。6、CHIP实验研究STAT3与VEGFA的结合位点。7、荧光素酶报告基因实验检验STAT3与VEGFA上的启动子1(BS1)的结合:构建携带有STAT3在VEGFA启动子上可能的结合位点BS1的野生型和突变型质粒(即PGL3-BS1WT/MUT)、高表达STAT3或空载的pcDNA3.1质粒(即质粒pcDNA3.1/STAT3 或 pcDNA3.1)以及抑制表达 STAT3 的 siRNA(即 si-STAT3#1 和si-STAT3#2,分别为序列不同位点的干扰序列)。实验分组为PGL3-BS 1 WT/MUT+si-NC 组、PGL3-BS1WT/MUT+si-STAT3#1 组、PGL3-BS1WT/MUT+si-STAT3#2 组、PGL3-BS1 WT/MUT+pcDNA3.1 和PGL3-BS1WT/MUT+pcDNA3.1/STAT3组。各组详细情况见正文。转染24小时后加5μ M的阿霉素处理24小时后进行荧光素酶检测。相关DNA质粒0.5 μg,相关siRNA100nM,10 μ L。8、检测miR-526b-3p与STAT3的结合:将构建好的含 STAT3 3’UTR野生型和突变型质粒psiCHECK2-STAT3 WT/MUT与细胞转染时分为psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+NC mimics 组、psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+miR-526b-3p mimics 组、psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+NC inhibitor 组 和 psiCHECK2-STAT3 WT/MUT+miR-526b-3p inhibior组。各分组详细情况见正文。相关质粒0.5μg,相关miRNA制剂0.25 μ L,转染36小时后加终浓度为5 μ M的阿霉素,继续处理12小时再进行荧光素酶检测。结果:1、miR-526b-3p负性调控VEGFA及作用方式:①miR-526b-3p负性调控VEGFA:与NC mimics组相比,VEGFA mRNA水平在miR-526b-3p mimics组显著下降,分别为 1.00±0.15 和 0.33±0.03(p<0.01);与 NC inhibitor 组相比,VEGFA mRNA 水平在miR-526b-3p inhibitor 组显著上升,分别为 1.00±0.13 vs 3.41±0.58(p<0.01)。②miR-526b-3p 与 VEGFA 3’UTR 无结合作用:对比 DOX+NC mimics 组,DOX+miR-526b-3p mimics组的EGFP荧光素酶活性并没有明显变化,分别为1.00±0.11 和 1.07±0.15(p>0.05);对比 DOX+NC inhibitor 组,DOX+miR-526b-3p inhibitor组的EGFP荧光素酶活性并没有明显变化,分别为1.00±0.15和0.96±0.13(p>0.05)。③miR-526b-3p 抑制 VEGFA 的启动子活性:与 NC mimics 组相比,miR-526b-3p mimics组的VEGFA启动子活性显著受到抑制,分别为1.00±0.13和0.30±0.04(p<0.01);与NC inhibitor组相比,miR-526b-3p inhibitor组的VEGFA的启动子活性显著升高,分别为 1.00±0.10 和 2.47±0.38(p<0.01)。2、JASPAR分析显示VEGFA启动子和STAT3具有两个有效的结合位点(BS1,BS2),生物信息学软件Starbase2.0查找到STAT3与miR-526b-3p之间结合的潜在靶点序列。3、STAT3正向调节VEGFAmRNA的表达:与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的VEGFA mRNA表达水平显著降低,分别为1.00±0.17、0.35±0.05和0.30±0.04(p<0.01);与 pcDNA3.1 组相比,pcDNA3.1/STAT3 组的 VEGFA mRNA 表达水平显著升高,分别为1.00±0.18和3.32±0.42(p<0.01)。4、染色质免疫共沉淀实验检验STAT3在BS1与VEGFA结合:在 BS1 结合位点中 IgG 与 STAT3 分别为 0.93±0.10 和 28.29±4.7(p<0.01);在BS2 结合位点中 IgG 与 STAT3 分别为 0.96±0.11 和 1.23±0.20(p>0.05)。5、荧光素酶实验检验STAT3在预测位点1(BS1)与VEGFA启动子结合:在BS1野生型组中,与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的荧光素酶活性被显著抑制,分别为 1.00±0.15 和 0.29±0.04/0.33±0.05(p<0.01);与 pcDNA3.1 组相比,pcDNA3.1/STAT3组的荧光素酶活性显著升高,分别为1.00±0.13和2.52±0.38(p<0.01)。在BS1突变组中,与si-NC组相比,si-STAT3#1组和si-STAT3#2组的荧光素酶活性无明显变化,分别为1.00±0.16、1.04±0.15和0.88±0.13(p>0.05);与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1/STAT3组的荧光素酶活性无明显变化,分别为1.00±0.11和 1.00±0.13(p>0.05)。6、miR-526b-3p负向调控STAT3:构建STAT3野生型和STAT3突变型荧光素酶报告基因,在STAT3-WT中,对比NC mimics组,miR-526b-3p mimics组的荧光素酶活性显著下降,分别为1.00±0.13和0.16±0.05(p<0.01);对比NC inhibitor组,miR-526b-3p inhibitor组的荧光素酶活性显著升高,分别为1.00±0.15和2.39±0.38(p<0.01)。在STAT3-MUT 组中,NC mimics 组、miR-526b-3p mimics 组、NC inhibitor组和miR-526b-3p inhibitor组的荧光素酶活性不变,分别为1.00±0.14、1.01±0.11、0.92±0.14和0.96±0.11,差异无统计学意义(p>0.05),说明miR-526b-3p负向调控STAT3。结论:miR-526b-3p通过与VEGFA启动子而非其3’ UTR结合实现其负向调控作用,JASPAR分析结果表明VEGFA启动子和STAT3具有两个有效的结合位置(BS1,BS2),且STAT3通过与VEGFA启动子的BS1位点结合实现对VEGFA的正向调控作用;而miR-526b-3p又通过STAT33’ UTR负向调控STAT3,综合分析得出,miR-526b-3p负向调控STAT3从而抑制VEGFA的转录,至此,我们发现miR-526b-3p/STAT3/VEGFA这一环路参与了阿霉素相关的心肌微血管、心脏功能损伤。