论文部分内容阅读
目的筛选与哮喘CD4~+T细胞Th2分化相关的微小分子RNA（miRNA），探讨其在该分化过程中的靶向调控机制及意义。方法（1）构建急性哮喘小鼠模型，将Balb/c小鼠分为正常组和哮喘组。使用miRNA芯片分别检测正常组和哮喘组小鼠CD4~+T细胞miRNA表达谱，找出两者间存在差异的miRNA。生物信息学软件（mirbase、miranda和targetscan）筛选出这些差异miRNA的候选靶基因后，利用KEGG软件对靶基因进行信号转导通路富集分析。（2）构建急性哮喘小鼠模型，将Balb/c小鼠分为正常组、哮喘组和治疗组。细胞涂片法检测各组支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞总数和嗜酸粒细胞（Eos）数的变化；Elisa法检测BALF中IL-4和IFN-γ含量的变化； qRT-PCR法测定脾脏CD4~+T细胞中miRNA-181a、miRNA-146a、miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-150表达水平的变化；Spearman相关分析明确miRNA与BALF中炎症细胞总数及Eos数之间有无相关性。（3）利用电穿孔技术，将miRNA-181a拟似物和抑制剂分别体外转染进入小鼠脾脏CD4~+T细胞。qRT-PCR法检测干预前后CD4~+T细胞内miRNA-181a和DUSP6mRNA的表达变化，BrdU Elisa法检测拟似物干预前后CD4~+T细胞增殖率的变化，Elisa法检测CD4~+T细胞分泌的IL-4和IFN-γ在拟似物干预前后的含量变化，流式细胞技术检测抑制剂干预前后Th1和Th2细胞比例的变化。结果（1）miRNA芯片检测发现，与正常组小鼠相比，哮喘组小鼠脾脏CD4~+T细胞中共有48个miRNA表达存在明显差异(判定阈值为两组间miRNA表达水平达到1.5倍以上差异)；表达水平上调的miRNA为39个，其中前3位分别是miRNA-29b、miRNA-451和miRNA-146b；表达水平下调的miRNA为9个，其中前3位分别是miRNA-1843-3p、miRNA-378/miRNA-378b和miRNA-150。mirbase、miranda和targetscan三种软件同时对这些差异miRNA的靶基因进行预测，有773种靶基因能同时被这三种软件预测出，包括IL-13、FCER1A、MAP2K3、MAPK10、MAPK12、PIK3CD等。KEGG数据库分析提示该773种靶基因所涉及的信号转导通路富集于Fc epsilon RI、MAPK和ubiquitin mediated proteolysis等22条信号转导途径。对一些已报道与T细胞分化相关的miRNA利用qRT-PCR技术进行验证，结果提示在哮喘CD4~+T细胞中， miRNA-181a、miRNA-146a、miRNA-146b和miRNA-150的qRT-PCR检测结果明显上升（P <0.05），其中前三条与芯片结果一致。（2）造模第32天，哮喘组BALF中炎症细胞总数、Eos数和IL-4水平高于正常组（P <0.05）； CD4~+T细胞中miRNA-181a、miRNA-146a、miRNA-146b和miRNA-150表达水平高于正常组（P <0.05）。治疗组BALF中炎症细胞总数和Eos数低于哮喘组（P <0.05），IL-4水平与正常组或哮喘组相比无统计学差异； CD4~+T细胞中miRNA-146a表达水平低于哮喘组（P <0.05）。造模第37天，哮喘组BALF中炎症细胞总数和Eos数高于正常组（P <0.05），而IL-4水平与正常组相比无统计学差异； CD4~+T细胞中miRNA-181a、miRNA-146a、miRNA-146b、miRNA-155和miRNA-150表达水平与正常组相比无统计学差异。造模第32天和造模第37天各组BALF中IFN-γ含量比较后无统计学差异。 CD4~+T细胞中miRNA-181a、miRNA-146a和miRNA-146b和BALF中炎症细胞总数及Eos数之间存在正相关性。（3）miRNA-181a拟似物体外转染CD4~+T细胞后，miRNA-181a表达水平上调（P<0.05），DUSP6mRNA表达水平下调（P <0.05）， CD4~+T细胞培养上清中IL-4含量增加（P <0.05）；而miRNA-181a抑制剂体外转染CD4~+T细胞后，则可下调miRNA-181a的表达水平（P<0.05），上调DUSP6mRNA的表达水平（P<0.05），下调Th2细胞的比例。结论（1）哮喘CD4~+T细胞中存在多种表达异常的miRNA，它们能影响哮喘CD4~+T细胞的分化和增殖等功能。miRNA-181a、miRNA-146a、miRNA-146b和miRNA-150可能参与了调控CD4~+T细胞Th2分化的过程。（2）miRNA-181a、miRNA-146a和miRNA-146b在哮喘发病机制中具有促炎性作用；地塞米松可通过调节miRNA-146a的表达水平而发挥抗炎作用，但它对miRNA-181a和miRNA-146b影响不明显。糖皮质激素的抗炎作用可能与其下调miRNA-146a表达水平有关。（3）miRNA-181a拟似物通过下调DUSP6mRNA促进哮喘CD4~+T细胞Th2分化；而miRNA-181a抑制剂则可通过上调DUSP6mRNA的表达水平，有效抑制CD4~+T细胞Th2分化，miRNA-181a有望成为抑制哮喘Th2炎症的重要靶点。