近几年来,基因编辑技术得到高速发展,实现了高效得对基因组进行定点修饰,同时能在各种物种以及细胞中实施。CRISPR/Cas9技术是目前应用最广的基因编辑技术。该系统中的CAS9蛋白能在sgRNA(single guide RNA)引导下对靶位点进行切割形成DSB缺口,引发细胞通过非同源性重组机制或者同源性重组机制进行DNA损伤修复。大量研究利用CRISPR/Cas9系统引发的非同源性重组机制实现了基因敲除,也利用细胞同源性重组机制实现了外源DNA片段的定点插入。本研究将以Kdm2b基因为例,利用CRISPR/Cas9技术构建了 Kdm2b敲除小鼠。同时也利用该技术在小鼠成纤维细胞系中实现Loxp序列的定点敲入,建立小鼠Kdm2b条件性敲除的技术体系,为后续的Kdm2b条件性敲除小鼠的构建奠定基础。本研究首先在Kdm2b基因的第七个和第九个外显子两端设计了 4个用于引导Cas9蛋白进行靶向切割的SgRNA序列,并构建了带有目的sgRNA的CRISPR质粒。将质粒分别转染到NIH3T3细胞中,对4个SgRNA的切割效率以及脱靶效率进行了检测。实验结果筛选到了一对切割效率高,脱靶率低的SgRNA(SgRNA5-2和SgRNA3-2)。进一步在小鼠受精卵中进行了 mRNA细胞质显微注射,将kdm2b的SgRNA以及Cas9蛋白的mRNA注射到原核期的小鼠受精卵中,成功得到了 Kdm2b敲除小鼠。针对SgRNA5-2和SgRNA3-2的切割位点,设计了带有loxp的同源重组片段,并在NIH3T3细胞中进行了 Loxp的敲入实验。实验结果表明,本研究所设计的双链的同源重组片段与相对应的sgRNA共转染到NIH3T3细胞中能成功实现Loxp的定点敲入。为了进一步提高同源重组效率,本研究在制备双链同源重组片段的引物的5端加上磷酸基团的修饰,在体外利用Lamda核酸外切酶的作用,制备出长片段的单链同源重组模板。将该模板分别与sgRNA共转染到NIH3T3细胞中,探究自制的长片段单链模板用于loxp定点敲入的效率。实验结果表明,通过测序验证,本研究成功制备出了长片段的单链DNA片段。进一步的细胞实验证明,单链比双链的同源重组模板具有更高的同源重组效率。综上所述,本研究在NIH3T3细胞中成功设计并验证了用于构建Kdm2b条件性敲除小鼠所需的sgRNA以及相对应的同源重组模板;建立了长片段单链DNA模板的制备体系,并成功应用于同源重组;在小鼠原核期的受精卵中进行了 sgRNA和Cas9的mRNA胞质注射,成功获得kdm2b敲除小鼠。本研究为利用CRISPR/Cas9技术制备Kdm2b条件性敲除小鼠以及其他基因修饰小鼠的制备奠定了坚实基础。