烟曲霉gfdA编码的3-磷酸甘油脱氢酶与相关通路成员及HOG途径关系的研究

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腐生丝状真菌烟曲霉是一种重要的条件致病菌,能够引起免疫缺陷病人获得侵袭性曲霉感染,严重的甚至导致患者的死亡。在烟曲霉中,甘油的生物合成对于分生孢子的产生和应对渗透压力是很重要的,但是对于调控该生物合成的相关基因还知之甚少。在模式生物构巢曲霉中对编码NAD+依赖的3-磷酸甘油脱氢酶(G3PDH)的基因gfdA有了一定的研究,证实了它编码G3PDH酶,并且构巢曲霉中gfdA的缺失菌有渗透压恢复的现象。鉴于此,本课题以烟曲霉为实验材料,研究了烟曲霉gfdA的相关生物学功能。首先,我们将构巢曲霉gfdA基因同烟曲霉基因组进行了比对,发现了AfgfdA和AfgfdB两个同源基因。我们用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑后,获得了AfgfdA和AfgfdB的敲除菌。经实验表明:AfgfdA敲除菌与野生型相比,生长病态,菌落变小,菌丝延伸和产孢受阻;而AfgfdB敲除菌生长情况与野生型无差异;ΔgfdBΔgfdA的双敲菌株表型跟ΔdA一致,这也验证了烟曲霉中编码有功能的G3PDH的基因主要gfdA而不是gfdB。为了进一步确认病态表型确实是由该基因缺失而导致的,我们做了回补实验,回补菌与野生型表型一致,这也证明了我们的敲除菌构建是成功的。其次,为了进一步分析gfdA在烟曲霉甘油代谢途径中所起的作用,我们将ΔgfdA菌株在以甘油为碳源的培养基中培养,发现其生长与野生型无异,而加入其它碳源(乙醇、果糖、葡萄糖)后病态表型没有缓解,这说明该基因确实参与了甘油代谢过程。为了进一步研究该病态表型是如何引起的,我们将烟曲霉中glcA基因进行了敲除,该基因编码甘油激酶。ΔglcA菌株在以甘油为碳源的培养基中产孢减少,菌落变小。ΔglcAΔgfdA双敲菌株很病态,无论是甘油为碳源的培养基还是葡糖糖为碳源的培养基都不能正常生长。因为这两个基因编码的蛋白酶都是催化合成甘油-3-磷酸的,所以我们推测是因为甘油-3-磷酸的减少而导致的ΔgfdA菌株病态的,这可能与细胞壁整合途径(CWI)有关,具体机理还有待进一步探索。这一结果与构巢曲霉是一致的。再次,为了更多地了解烟曲霉甘油代谢途径gfdA与其它成员的关系,我们对编码3-磷酸甘油酯酶的基因gppA进行了敲除,但是ΔgppA并没有呈现出病态表型,ΔgppAΔgfdA双敲菌株的表型与单敲gfdA的表型是一致的,这也说明3-磷酸甘油酯酶的失活并没有对甘油代谢产生影响。然后,为了研究烟曲霉gfdA与HOG途径的关系,我们在基本培养基上加入1.2M多元醇(甘露醇、赤藓醇、山梨醇)和1M盐类(NaCl和KC1)后创造高渗透压的环境来培养ΔgfdA菌株,发现渗透压会弥补AfgfdA缺失菌株的缺陷。可能是因为它们的加入导致胞外渗透压增高,激活了胞内HOG途径,迫使细胞内产生一些生物相容性物质来缓解渗透压力,使得表型得以恢复。ΔglcAΔgfdA双敲菌株在渗透压下也恢复成与野生型一致的表型,显然该表型的恢复不是依赖甘油-3-磷酸的积累。烟曲霉有4个MAPKS,分别是MpkA,MpkB,MpkC和SakA,而mpkC和sakA是酿酒酵母hog1的同源基因,其中SakA是高渗透压甘油响应途径的主要调节子。已经有研究证明,在敲除sakA基因后,发现它对盐逆境敏感。而我们在ΔsakA敲除菌上再敲除gfdA后,在渗透压下培养表型没有得到恢复,发现菌落生长比单敲gfdA更加病态。这说明,单敲gfdA在渗透压力下恢复表型的前提是sakA基因没有失活。最后定量PCR实验证明,在渗透压逆境下,gfdA表达增加将近20倍,而gfdB、gppA、glcA表达量变化不大;但是当sakA失活后,渗透压逆境下,gfdA表达增加了才7倍,其余基因变化也不是很大。这也间接说明渗透压逆境下可能也伴随着其它途径的激活。综上所述,烟曲霉中gfdA基因与构巢曲霉中gfdA基因的功能基本一致,另外我们发现多元醇也会使ΔgfdA恢复正常生长,研究了甘油代谢途径中其它成员的作用,并且我们验证了渗透压下HOG途径确实调控gfdA,同时伴随着其它途径的激活。
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