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研究背景:多发性硬化被认为是CD4~+Th1细胞介导的自身免疫病,Th1介导细胞免疫引起自身免疫的相关理论在研究中占主导地位。近年来,国内外已有研究证明Th17细胞在自身免疫性中枢神经脱髓鞘疾病中的地位,Th17与调节性T细胞失衡可能也是引起疾病发病的一个重要机制。此外,研究表明,体液免疫在MS的发病中也有重要作用。其中B细胞在MS发病中的机制仍不是非常清楚。MS患者鞘内IgG合成提示有特异性抗体产生。由于在病理检查中病灶区除了有髓鞘脱失,还有轴突变性。髓鞘与轴突蛋白可能是自身抗体攻击的靶抗原。因此寻找与神经轴索变性有关的抗体既可证实体液免疫在MS发病中的作用,也可找到一种有利于MS诊断的生物学指标。目的:建立并评估实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型;探讨在EAE小鼠起病前、疾病高峰期、缓解期的T细胞、B细胞及其亚群的变化;探讨在EAE小鼠发病的不同阶段细胞因子的变化;探讨自身抗原磷酸丙糖异构酶(TPI)及三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体水平在EAE小鼠的表达,寻找可能的靶抗原,及在不同的的疾病阶段免疫反应的类型及相互间的影响。方法:C57BL/6小鼠随机分为:EAE组(n=18),采用髓鞘少突细胞糖蛋白(MOG)35-55多肽/完全弗氏佐剂(CFA)的方法制备EAE模型;对照组(n=18),用生理盐水处理小鼠。免疫0d、3d、7d、14d、21d、30d时取外周血进行流式细胞检测T细胞亚群(Th1、Th2、Th17、Treg、γδT细胞)及B细胞亚群(初始成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞)。免疫后第7d(发病前期),免疫后第18d(发病高峰期),免疫后第30d(缓解期),取大脑及脊髓,进行HE染色和LFB染色,免疫组化检测T细胞及B细胞亚群相关蛋白在组织中的定位。同期取组织匀浆上清液,ELISA检测小鼠脑及脊髓组织中T细胞及B细胞相关细胞因子及TPI、GAPDH抗体的变化。分析EAE小鼠神经功能障碍不同的的疾病阶段免疫反应的类型及相互间的影响。结果:1.利用MOG35-55多肽/完全弗氏佐剂诱导C57BL/6小鼠可成功建立EAE动物模型。EAE组的小鼠均出现临床症状,平均体重低于对照组,神经功能评分高于对照组,具有统计学差异(P<0.05);EAE小鼠脑及脊髓组织HE染色结果中,观察到EAE小鼠脑及脊髓组织中出现大量炎症细胞浸润;同时EAE小鼠脊髓组织的LFB染色发现存在大片状气球样空泡变性的髓鞘脱失区域,为LFB未着色区。2.流式细胞检测结果显示Th1细胞在对照组从第0d直至31d无明显变化,EAE组第14天开始与基线相比下降,并于14、21、30d低于对照组,有显著性差异(P<0.05)。Th2细胞在对照组从第0d直至31d无明显变化,EAE组第14天开始与基线相比上升,在3、7、14、21d高于对照组,有显著性差异(P<0.05)。Th17细胞在对照组从第0d直至31d无明显变化,EAE组第3d开始与基线相比上升,并于3、7、14、21d高于对照组,有显著性差异(P<0.05)。Treg细胞两组均低表达,统计无差异。γδT细胞EAE组第14天与基线相比增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。免疫组化染色示在脊髓组织中EAE组各T细胞相关蛋白的表达水平显著高于对照组,在脑组织中EAE组与对照组相比蛋白水平较高但是没有脊髓组织中显著。EAE组IL-10、IL-23、TNF-?含量在7d时高于对照组,IL-10、IL-17、IL-23含量在18d时也高于对照组,均有统计学差异(P<0.05)。此外EAE组IL-10、IL-17、IL-23在18d与7d相比增多以及IL-23在30d时与18d相比下降均有统计学差异(P<0.05)。3.流式细胞检测结果显示初始成熟B细胞在EAE组于7d开始降低,并维持到30d,与基线相比有统计学差异(P<0.05)。在14、21、30dEAE组低于对照组,有统计学意义(P<0.05)。记忆性B细胞EAE组均低于对照组,在3、7、14、21d与基线相比上升有统计学差异,在3、7d与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。浆细胞在14、21d与基线相比上升有统计学差异,14d与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。免疫组化染色示B细胞亚群相关因子表达水平在脊髓组织中EAE组各蛋白的表达水平显著高于对照组,在脑组织中EAE组与对照组相比无明显差异。EAE组IL-10、IL-12、TNF-?含量在7d时高于对照组,IL-10含量在18d时也高于对照组,均有统计学差异(P<0.05)。此外,EAE组IL-10在18d与7d相比增多有统计学差异(P<0.05)。4.EAE组TPI、GAPDH含量在7d时高于对照组,但于18d时均下降且低于对照组,有统计学差异(P<0.05)。结论:通过MOG35-55/CFA的方法免疫C57BL/6小鼠可成功建立EAE动物模型,且操作简便,可靠,模型具有良好的稳定性和可重复性。EAE小鼠发病的早期Th17细胞即增高并在整个疾病过程保持高水平,提示Th17细胞是介导疾病发生的关键T淋巴细,并于整个疾病阶段均起作用。作为保护性T细胞,Treg细胞明显下降,提示Th17/Treg失衡才是疾病发生与进展的原因。B淋巴细胞自免疫后即参与其中,且各类B细胞按照分化顺序依次表达,而且并非仅以产生抗体的形式致病。分泌致病性细胞因子是其主要作用机制。GAPDH、TPI抗体在疾病早期曾有表达,可能是对神经元及轴突的损伤原因之一,但并非贯穿整个病程的致病抗体。