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糖尿病肾病是糖尿病患者最常见的血管并发症之一,也是导致终末期肾脏衰竭的重要原因。基本的病理改变表现为肾小球细胞外基质的堆积、系膜增宽、基底膜增厚,直至发展到肾小球硬化及肾间质纤维化。临床特点表现为大量蛋白尿的出现,且与糖尿病的严重程度密切相关。长期大量蛋白尿的出现不但能够进一步加重肾小球滤过膜的损伤,导致肾小球的硬化,而且还会促使肾小管上皮细胞摄取蛋白尿中的某些有害成分,造成肾小管的损伤以及肾间质的纤维化,并最终导致肾衰竭。肾小球脏层上皮细胞即足细胞,在蛋白尿的发生过程中起到重要的作用。研究表明,人以及实验性的糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)均与足细胞的凋亡和脱落相关,并且足细胞受损脱落后便会缺乏再生的能力。受损后的足细胞出现数量和密度的减少,而残存的足细胞为覆盖裸露的肾小球基底膜(Glomerular basement membrane, GBM)而出现代偿性肥大、足突增宽、融合,从而使肾小球滤过屏障的通透性增加,导致大量蛋白尿的发生。Nephrin作为裂孔隔膜的主要成分,参与了细胞的信号转导,并维持着足细胞的正常形态和功能,其基因和(或)蛋白表达的异常在蛋白尿的发生机制中有着相当重要的作用。总之,足细胞损伤是导致DN持续性进展的关键细胞,足细胞裂孔隔膜上的nephrin更是肾小球滤过屏障选择性功能的关键,对此领域的进一步研究有可能引发DN发病机理以及诊断治疗上的新突破。根据导师李建民教授所提出的中医“肾络瘀痹”理论是慢性肾脏疾病进展的关键因素的假说,选用导师治疗慢性肾衰竭的临床经验方“通络保肾复方”(Compound Tongluo Baoshen Prescription, CTLBSP)进行防治糖尿病肾病的系列实验研究,通络保肾复方由太子参、女贞子、丹参、大黄、水蛭、三七、川芎、牛膝八味中药组成,具有补肾祛邪、活血通络的功效。本文对此展开系列研究,旨在探讨该方防治糖尿病肾病的作用机制。1目的本实验进采用改进的血清药理学方法将通络保肾复方经口给予大鼠灌胃后取其血清作为药源,并加入外源性的脂多糖(LPS)作为刺激物进行研究,探讨通络保肾复方对培养的大鼠肾小球足细胞表达nephrin的影响,以期为中医药临床防治糖尿病肾病提供科学实验依据。2方法2.1选用大鼠肾小球足细胞,通过LPS刺激后,给予大鼠通络保肾复方含药血清干预,采用MTT法检测12h,24h,36h和48h时肾小球足细胞的增殖影响。2.2通过LPS刺激大鼠肾小球足细胞,给予大鼠的含药血清干预后,进行足细胞爬片和胞浆蛋白的提取,用细胞免疫组化法检测大鼠肾小球足细胞nephrin蛋白的表达,用western blot检测nephrin的蛋白含量。3结果3.1 MTT：肾小球足细胞在LPS刺激后的各时相点即12h、24h、36h及48h明显增殖,LPS组与各组比较差异显著(p<0.05)。厄贝沙坦和通络保肾复方能够一定程度的抑制LPS诱导的肾小球足细胞的增殖,在第12h开始起效(与LPS组相比,p<0.05),通络保肾复方最佳抑制时间为第48h,以通络保肾大剂量组效果最佳。3.2 Western blot:LPS刺激36h后,LPS组蛋白条带颜色明显较正常组弱,说明LPS组肾小球足细胞内nephrin蛋白明显减少,与正常组比较差异显著(p<0.05)。厄贝沙坦和通络保肾复方组蛋白条带颜色较深,与LPS组相比差异显著(p<0.05),说明通络保肾复方可以上调nephrin蛋白的表达,且有剂量依赖关系,与厄贝沙坦组比较无差异(p>0.05)。细胞免疫组化结果显示,LPS刺激36h后,与正常组比较,高糖组、LPS组肾小球足细胞胞浆内nephrin蛋白表达明显减少,差异显著(p<0.05)。与高糖及LPS组比较,厄贝沙坦和通络保肾复方组nephrin蛋白表达增加,差异显著(p<0.05),说明通络保肾复方可以上调nephrin蛋白的表达。4结论4.1通络保肾复方药物血清能够抑制LPS刺激的肾小球足细胞的增殖,从而延缓糖尿病肾病时的肾脏病理损伤。4.2通络保肾复方上调肾小球足细胞内nephrin的表达,降低蛋白尿的发生,以上可能是通络保肾复方延缓糖尿病肾病进一步发展的重要作用机制。