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Wnt/β-catenin途径是一个经典的Wnt信号通路,控制着多种关键的细胞过程。该通路的异常激活与患者的乳腺癌转移和总生存率降低有关。Wnt/β-catenin信号转导受多个水平的调控,包括Wnt配体的产生、释放和翻译后修饰,Wnt受体的稳定性,以及CHIBBY（Cby）等拮抗剂与Wnt及其受体或β-catenin的结合。Cby对该信号途径的抑制作用可以被甲状腺癌基因-1（TC-1,又称为C8orf4）解除,即上调的TC-1通过结合并抑制Cby增强Wnt/β-catenin信号通路,从而促进癌细胞的侵袭性生物学行为。我们前期的高通量测序结果提示,癌基因TBC1D3高表达可上调人乳腺癌MCF-7细胞中TC-1水平,但TBC1D3是否影响Wnt/β-catenin信号通路以及该通路在TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移中是否具有作用均不清楚。因此,我们进行以下的研究。一、目的:探讨TBC1D3对Wnt/β-catenin信号通路的影响以及该通路在TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移中的作用。二、方法:1.为研究TBC1D3高表达对人乳腺癌细胞的TC-1表达和迁移影响,以Flag空载体为对照,将Flag-TBC1D3等转染至MCF-7和BT-549细胞中,用或不用TNFα抑制剂Pom、NF-κB抑制剂CAPE或FGFR抑制剂BGJ-398处理细胞,用RT-PCR和Western blotting检测细胞中的TC-1 m RNA和蛋白水平,用划痕实验和Transwell实验检测人乳腺癌细胞的迁移。2.为研究TC-1介导TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移,构建敲低TC-1的四个慢病毒载体KD-TC-1（653）,KD-TC-1（1512）,KD-TC-1（1566）和KD-TC-1（1665）,经感染MCF-7细胞后,用1.5μg/ml嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞,并用Western blotting方法检测细胞中TC-1蛋白水平。以Flag空载体为对照,在TC-1显著敲低的稳定感染细胞中过表达TBC1D3,用划痕实验和Transwell实验检测人乳腺癌细胞的迁移。3.为研究Wnt/β-catenin信号通路介导TBC1D3和TC-1诱导的人乳腺癌细胞迁移,以Flag空载体为对照,将Flag-TBC1D3转染至MCF-7、KD-TC-1（1566）-MCF-7及BT-549细胞中,用RT-PCR和Western blotting分别检测细胞中Wnt/β-catenin通路下游靶基因MT1-MMP、c-Myc和Cyclin D1的m RNA和蛋白水平;用Wnt信号通路特异抑制剂XAV-939或激动剂SKL-2001处理转染细胞后,用划痕实验和Transwell实验分别检测人乳腺癌细胞的迁移。4.为研究TBC1D3、TC-1和β-catenin与浸润性乳腺癌转移和复发的相关性,在临床病理样本中,用免疫组织化学染色方法检测TBC1D3、TC-1和β-catenin在浸润性乳腺癌组织中的表达水平;用CT、核磁共振、PET-CT和全身骨扫描等影像学检查方法结合相关一致性检验、ROC曲线、5年无进展生存期（PFS）等手段分析病人的转移和复发情况。三、结果:1.TBC1D3以TNF/NF-κB依赖的方式促进人乳腺癌细胞的TC-1表达和迁移TBC1D3高表达能刺激非三阴性乳腺癌MCF-7细胞和三阴性乳腺癌BT549细胞中TC-1 m RNA和蛋白表达增加,但TNFα抑制剂Pom或NF-κB抑制剂CAPE处理细胞后,TBC1D3诱导的TC-1表达显著降低,而FGFR抑制剂BGJ-398无此作用。划痕实验和Transwell实验显示,TBC1D3和TC-1均能促进MCF-7细胞和BT549细胞的迁移。2.TC-1介导TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移与Flag空载体相比,TBC1D3和TC-1过表达可分别导致对照sh RNA-NC-MCF-7细胞的迁移显著增加。然而,敲低TC-1能显著抑制TBC1D3诱导的MCF-7细胞迁移,提示TC-1介导TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移。3.Wnt/β-catenin信号通路介导TBC1D3和TC-1诱导的人乳腺癌细胞迁移TBC1D3和TC-1过表达均能显著增加MCF-7和BT-549细胞浆和细胞核内β-catenin蛋白水平,使细胞中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因MT1-MMP、c-Myc和Cyclin D1的m RNA和蛋白水平上调。然而,敲低TC-1不仅能降低细胞浆和细胞核内β-catenin蛋白水平,使Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因MT1-MMP、c-Myc和Cyclin D1的m RNA和蛋白水平下调;而且敲低TC-1还可逆转TBC1D3诱导的β-catenin在胞浆和胞核中的积聚,显著抑制TBC1D3对Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达的刺激作用,提示TC-1可能介导TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活。与敲低TC-1相似,使用Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV-939处理细胞,也能抑制TBC1D3诱导的β-catenin在MCF-7和BT-549细胞浆和胞核中的积聚,使TBC1D3丧失刺激Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因MT1-MMP、c-Myc和Cyclin D1表达增加的作用,从而显著抑制TBC1D3诱导的MCF-7和BT-549细胞的迁移,提示Wnt/β-catenin信号通路介导TBC1D3和TC-1诱导的人乳腺癌细胞迁移。4.TBC1D3、TC-1和β-catenin高表达与浸润性乳腺癌转移和复发高度相关将36例乳腺癌患者临床样本进行免疫组织化学染色,结果显示TBC1D3与TC-1、TBC1D3与β-catenin、TC-1与β-catenin均具有中等一致性（κ系数分别为0.471、0.421、0.501）。回顾性分析这些患者的数据发现,94%TBC1D3阳性、80%TC-1阳性和84%β-catenin阳性的患者发生了乳腺癌转移,而TBC1D3、TC-1和β-catenin阴性的患者发生转移的比例分别仅为50%、40%和30%,这表明在TBC1D3、TC-1和β-catenin阳性人群较阴性人群中肿瘤转移的几率分别高出1.9、2.0和2.8倍。而且,TBC1D3、TC-1或β-catenin的表达使三阴性乳腺癌比非三阴性乳腺癌更容易转移。此外,ROC曲线提示TBC1D3、TC-1和β-catenin在预测乳腺癌转移方面比ER、PR、HER2和Ki-67更敏感、更特异。最后,PFS评估显示,TBC1D3、TC-1和β-catenin阳性的乳腺癌患者比TBC1D3、TC-1和β-catenin阴性的乳腺癌患者更有可能复发。四、结论:1.TBC1D3以TNF/NF-κB依赖的方式促进人乳腺癌细胞的TC-1表达;2.TC-1介导TBC1D3诱导的人乳腺癌细胞迁移;3.Wnt/β-catenin信号通路介导TBC1D3和TC-1诱导的人乳腺癌细胞迁移;4.TBC1D3、TC-1和β-catenin的表达与浸润性乳腺癌转移和复发具有相关性。