结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，病因尚未十分明确。全球结直肠癌每年发病新病例数达94万，每年近50万人死于结直肠癌。结直肠癌死亡居癌症死因第3位。结直肠癌在我国也是最常见的恶性肿瘤之一，目前居恶性肿瘤发病率第4位。目前早期发现及诊断结直肠癌的主要方法是纤维内镜检查，大便潜血、直肠指检与直肠镜结合，以提高直肠癌的早期诊断率，但是目前还没有一种更好的无创的早期诊断的血液诊断指标。肿瘤标记物作为结直肠癌的辅助诊断指标已经应用于临床，但是需要逐项去做，给临床检测带来较多的麻烦，同时试验成本也高，因此非常有必要研究开发一种可以同时检测多种肿瘤标记物的诊断技术，2000年诞生的生物芯片技术之高通量、平行检测的优势能满足这一需要。 目的 本课题选用临床上正在应用的血清标志物癌胚抗原(CEA)、糖链抗原199(CA199)、糖链抗原242(CA242)作为靶蛋白，采用一次可准确可靠测定多种靶分子的Luminex多色微球检测技术，研发可直接检测结直肠癌的血清标记物的液相芯片检测系统，即可做到正确的诊断结直肠癌，又能方便快捷，一次检测多个标记物，避免常规ELISA的繁琐，和接触有害物质的弱点，节约成本。 方法 1．CEA、CA199、CA242配对抗体的选择，包括用于结合肿瘤标记物的捕获抗体，和用于检测肿瘤标记物的浓度的检测抗体，两个抗体必须是识别待测肿瘤标记物的不同位点。 2．微球的选择：由于要检测的目标是蛋白质，因此选择羧基微球，可以与蛋白质的氨基结合，从而达到偶联的目的。 3．CEA、CA199、CA242检测抗体的生物素化：按照参考文献的方法进行，偶联后进行透析及柱纯化。 4．CEA、CA199、CA242的捕获抗体与微球的偶联：分别选用羧基微球5号、35号和79号，利用微球所含有的羧基分别与CEA捕获抗体、CA199捕获抗体和CA242捕获抗体中的的蛋白质分子中的氨基反应形成共价偶联，成为可捕获目的蛋白的靶分子。 5．包被好的微球与血清反应时间的优化：采用L<,9>(3<4>)正交法。 6．生物化的CEA、CA199、CA242检测抗体反应浓度以及反应时间的优化：采用L<,9>(3<4>)正交法。 7．SA-R-PE反应浓度及反应时间的优化采用L<,9>(3<4>)正交法。 8．标准曲线的拟合及可信限的确定：不同的标准肿瘤标记物的浓度范围不同根，标准品的浓度和标准曲线的拟合情况，确定测量的可信限范围。 9．Cutoff值的确定：通过查阅文献以及正常人与病人的样本的检测确定cutoff值，并进行肿瘤标记物液相芯片系统灵敏度、特异度评价。 10．芯片的重复性和稳定性实验：根据上述结果制备可同时检测3种肿瘤标记物的液相芯片，并对芯片的重复性和稳定性进行检测。 11．大肠癌肿瘤标记物平行检测液相芯片的应用及其与传统方法的比较及评价：应用研制的液相芯片对55例临床标本进行检测，并与酶联免疫吸附实验(ELISA)的检测结果比较，SPSS统计分析软件分析检测结果。 结果 1． CEA、CA199、CA242配对抗体的选择配对抗体经过查阅资料，选择从公司购买，包括：CEA捕获抗体、CEA检测抗体；CA199捕获抗体、CA199检测抗体；CA242包被抗体、CA242检测抗体。 2．羧基微球的选择根据公司的推荐及查阅资料选择5号、35号和79号微球 3．用ELISA的方法检验生物素化的抗体，经卡方检验，与商业化的抗体相比没有统计统计学差异。 4．微球包被好，用血细胞计数器计数微球的浓度，5号微球浓度1.5×10<6>个/ml，35号微球浓度1.1×10<6>个/ml，79号微球浓度1.3×10<6>个/ml。 5．标记物的捕获抗体与微球的偶联效果：将包被好的微球运用Luminex系统检测偶联效果： 包被CEA抗体的5号羧基微球平均荧光强度为18853.5，5号空白羧基微球平均荧光强度为82；包被CAl99抗体的35号羧基微球平均荧光强度为12500，35号空白羧基微球平均荧光强度为35；包被CA242抗体的79号羧基微球平均荧光强度为17019.5，79号空白羧基微球平均荧光强度为75。 6．包被好的微球与血清反应时间的优化：最优反应时间1小时。 7．生物化的CEA、CA199、CA242抗体反应浓度以及反应时间的优化：最优反应浓度为1:300稀释，最优反应时间1小时。 8． SA-R-PE反应浓度及反应时间的优化：最优反应浓度为12μg/ml，最优反应时间30分钟。 9．根据标准品的浓度和标准曲线的拟合情况，确定测量CEA、CA199和CA242可信限范围分别为150ng/ml、150U/ml和240U/ml。 10．通过查阅文献以及样本的检测确定CEA、CA199和CA242cutoff值分别为8ng/ml、37U/ml和20U/ml。 芯片的重复性和稳定性实验根据上述结果制备可同时检测3种肿瘤标记物的芯片，并对芯片的重复性和稳定性进行检测：经卡方检验，对同一标本进行连续检测，结果无显著性差异。最后优化的条件为： ①待检血清与500个包被好的微球反应1小时。 ②洗涤3次，每次2min。 ③加入1:300稀释好的生物素化的CEA、CA199和CA242检测抗体，反应1小时。 ④洗涤3次，每次2min。 ⑤按浓度12μg/ml加入SA-R-PE，反应时间30min。 ⑥luminex100检测：全程的实验时间大约2.5小时完成，大大的缩短了试验时间，较目前采用的方法简便快速，而且有高通量的特点。 11．对55份临床血清分别用液相芯片和ELISA方法进行检测，发现两种检测方法检测结果无统计学差异(p>0.05)。 结论 建立了基于抗原抗体反应的液相蛋白芯片系统，并且制备了能同时检测3种大肠癌肿瘤标记物的液相蛋白芯片，并优化出了最佳反应条件。将目前对肿瘤标记物的单个检测到多种标记物的平行检测的目的，具有样本用量少、节约时间、操作简便、价格低廉等优点。该方法具有较强的临床检测使用价值，为进一步开发更多肿瘤标记物平行检测的液相芯片产品奠定了技术基础。