三种侵染木本植物的病毒鉴定

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高通量测序技术(High-throughput sequencing)又被称为第二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS),其凭借低成本、高灵敏度、速度快、高通量的优势,自首次在病毒检测中应用以来,在近几年获得快速发展。目前利用高通量测序技术已发现数百种新病毒,极大改变了人类对病毒种群数量和进化的认识和了解。高通量测序技术可以实现对未知病毒的快速检测,在植物病毒诊断研究领域的发展中发挥着重要作用,已被广泛应用于植物病毒的检测当中。本研究基于高通量测序技术,对丁香和马缨丹进行了病毒检测与鉴定,通过结合应用Rapid ampfilication of c DNA end(RACE)实验、Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)测定了侵染丁香和马缨丹植物的三种病毒基因组全长序列。2018年10月,在陕西延安采集了表现褪绿环斑症状的丁香叶片样本,通过高通量测序技术发现为一种新病毒,同时确定了该病毒的基因组是由5条负义单链RNA组成。通过设计特异性引物对5条RNA单链分别进行RT-PCR扩增及测序,结合RACE实验确定了5条病毒链确切的3’和5’末端序列,进而获得了该病毒的完整序列。5条病毒链的全基因组分别长7047 nt、2268 nt、1559 nt、1657nt和1269 nt,且5条病毒链的两端约13 bp序列存在反向互补的特点。通过在NCBI中进行序列比对,发现侵染丁香的病毒与布尼亚病毒目(Bunyavirales),无花果花叶病毒科(Fimoviridae),欧洲山梣环斑病毒属(Emaravirus)的病毒同源性最高,但是同源性均低于70%,因此将其确定为一种病毒新种,命名为丁香褪绿环斑相关病毒(lilac chlorotic ringspot-associated virus,Li CRa V)。2017年,在上海植物园中采集到病症表现为斑驳的马缨丹叶片样本,高通量测序发现其存在两种病毒复合侵染的现象,且这两种病毒均为正义单链RNA病毒。根据获得的序列设计特异性引物对病毒进行RT-PCR检测,并通过RACE实验获得病毒的全基因组序列,进而获得侵染马缨丹植物的两种病毒的完整序列,两种病毒全长序列分别为6463 nt和6486 nt。通过将获得的完整病毒序列在NCBI中进行比对,发现这两种病毒为杆状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的新加坡木槿潜隐环斑病毒(hibiscus latent Singapore virus,HLSV)分离物和皮尔斯堡木槿潜隐环斑病毒(hibiscus latent Fort Pierce virus,HLFPV)分离物。同时发现这两种病毒都存在着一个特殊的内部poly(A)结构。这是两种病毒在中国的首次报道。
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