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目的:MAPKs是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的细胞内信号转导酶类,是细胞质与细胞核联系的关键途径。研究发现,MAPKs信号转导通路在脑缺血及脑缺血耐受诱导过程中可能发挥重要作用。p38 MAPK是1993年发现的MAPK家族的一种亚型,由360个氨基酸组成的38KDa的蛋白。研究发现亚致死量的脑缺血(2分钟全脑缺血)通过激活p38 MAPK而提高蒙古沙鼠海马锥体神经元的缺血耐受性,使其能够耐受其通常情况下无法耐受的严重脑缺血(5分钟的全脑缺血);p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580能够剂量依赖性地阻断2分钟全脑缺血所诱导的脑缺血耐受。但是,p38 MAPK在脑缺血耐受诱导过程中的作用及机制还远未阐明。因此,本次实验旨在探讨在体情况下,全脑缺血预处理中p38 MAPK在海马中的表达,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和依据。方法:健康雄性Wistar大鼠160只,体重280-320g,随即分为4组。所有大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行sham手术或脑缺血处理,具体分组如下:①sham组(n=40):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;②脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉3 min后恢复再灌注;③损伤性缺血(ischemic insult, II)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;④脑缺血预处理+损伤性缺血(CIP+II)组(n=40):夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。每个组又根据末次缺血或手术后动物存活时间的不同分为8个时间点:即刻(0分钟)、15分钟、30分钟、3小时、1天、2天、4天、7天,每个时间点n=5。在规定的时间点,断头取海马脑组织,硫堇染色进行神经病理学评价;免疫组织化学染色法检测p-p38 MAPK的表达。参照Kato分级方法,于光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级(Histological grade, HG),标准如下:0级,无神经元死亡;1级,散在神经元死亡;2级,成片神经元死亡;3级,几乎全部的神经元死亡。取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段,取平均数为神经元密度(Neuronal density, ND)。结果:1神经病理学评价Sham组大鼠海马CA1区,可见锥体神经元排列整齐、致密、共2～3层,细胞形态完整,胞核饱满,核仁清晰。HG为0～Ⅰ级。CIP组,各时间点锥体神经元的形态、结构及数量没有明显区别,海马CA1区无明显的DND,HG为0～Ⅰ级,7d时ND分别为204±7.21和194.67±8.08。II组8 min缺血打击后,从4d开始海马CA1区出现明显的DND,7d时HG为Ⅱ~Ⅲ级、ND为17.33±11.37。与sham组相比,HG明显升高(P<0.01),ND显著降低(P<0.01)。CIP+II组各时间点海马CA1区无明显DND,7d时HG为0～Ⅰ级,ND为190.67±4.16。与II组相比,HG明显降低(P<0.01),ND显著升高(P<0.01)。表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生脑缺血耐受,使其能够抵抗通常会引起明显DND的严重脑缺血。CA3区的椎体神经元,在各组的各个时间点均未见到明显损伤。2磷酸化p38 MAPK在大鼠海马CA1区的表达2.1同组不同时间点的比较sham组海马CA1区免疫阳性细胞形态完整,胞核胞浆界限不清,为浅棕黄色。各时间总面积和平均光密度均无显著性差异。CIP组在15min时胞核着色开始变深,3h、1d时胞核明显,呈深棕黄色,以3h最为明显,此后神经元胞核着色逐渐变浅,至7d时回落至即刻取材时间点水平。与即刻取材时间点相比,p-p38 MAPK阳性标记物的总面积在15min~4d均明显增高,但以1d最显著,平均光密度在15min~1d时明显升高,以3h最显著(p<0.05)。II组在即刻取材时间点免疫阳性物质表达量少,15min开始逐渐增多,3h、1d达高峰,胞核呈均匀的深棕黄色。与即刻取材时间点相比,其阳性标记物的总面积和平均光密度在15min~2d均明显升高(p<0.05),其中总面积以1d为最显著,平均光密度以3h最显著。4d和7d时表达量明显降低,并有少量胶质细胞着色,且着色程度明显比神经元深,与即刻取材时间点相比,其染色总面积和平均光密度没有明显变化。CIP+II组,即刻取材时间点可见免疫阳性物质有一定量表达。15min时阳性标记物的表达明显减少,细胞较稀疏,与即刻取材时间点相比阳性细胞的染色面积明显减少(p<0.05),而平均光密度没有明显变化。30min时免疫阳性细胞表达开始增多基本和即刻取材时间点持平,胞核着色也开始加深至3h、1d、2d时神经元着色明显加深(p<0.05),以2d最为明,4d时神经元着色明显变浅,基本恢复至对照组水平,并持续至7d。2.2同一时间点不同组之间比较即刻取材时间点,sham组、CIP组和II组其免疫阳性标记物的总面积和平均光密度三组之间没有明显差异;CIP+II其阳性标记物的总面积与II组相比明显升高,而平均光密度没有明显差异。在15min时, CIP组、II组与sham组相比阳性标记物的总面积和平均光密度均明显升高(p<0.05),II组阳性标记物总面积升高更明显。CIP+II组与II组比较免疫阳性细胞表达减少,其染色总面积、平均光密度均明显降低。30min时,CIP组、II组与sham组相比其染色总面积、平均光密度均明显增高(p<0.05)。II组与CIP组相比,其免疫阳性标记物总面积、平均光密度均明显升高。CIP+II组与II组比较阳性标记物的平均光密度明显降低、但总面积没有明显变化。3h~2d时,CIP组、II组与对应时间点的sham组相比,阳性标记物的总面积和平均光密度均明显升高,但II组升高的更为显著。CIP+II与同时间点的II组相比,其阳性标记物总面积在1d和2d时均明显减少(p<0.05)。4d时,与sham组比较,CIP组的阳性标记物总面积、平均光密度均明显增高(p<0.05); II组由于细胞发生迟发性神经元死亡,其阳性标记物总面积较小,但平均光密度明显增高(p<0.05)。CIP+II组与II组比较阳性染色总面积明显升高。7d时,与sham组比较,CIP组的阳性标记物总面积明显增高(p<0.05)。II组的总面积与sham组比较无明显差异。CIP+II组的阳性标记物总面积比II组明显增高(p<0.05)。3 p-p38 MAPK在海马CA3区的表达sham组的各时间点之间相比,p-p38 MAPK阳性标记物总染色面积和平均光密度没有显著差异。CIP组,与即刻取材时间点相比,在1d时免疫阳性标记物总面积明显增多(p<0.05),胞核深染,平均光密度也明显升高(p<0.05)。II组,与即刻取材时间点比较,p-p38 MAPK阳性标记物的总面积在30min~2d时均明显升高(p<0.05)以2d最为突出。CIP+II组,在即刻取材时间点,胞核着色均匀一致,染色为浅棕黄色,15min时胞核染色明显加深(p<0.05),但阳性标记物的总面积和即刻取材时间点比较明显降低(p<0.05)。30min~1d免疫阳性细胞表达较15min时有所增多,但仍明显低于即刻取材时间点水平。在2d时,阳性标记物的总染色面积升高到即刻时间点水平,胞核深染,与即刻点比较p-p38 MAPK免疫阳性细胞的总染色面积没有明显变化,平均光密度显著增高(p<0.05)。4d、7d时免疫阳性细胞表达明显减少,细胞轮廓不清,胞核着色明显变浅,与即刻取材时间点比较,免疫阳性细胞的总染色面积和平均光密度均明显降低(p<0.05)。结论:1缺血打击可以使海马CA1区锥体神经元发生迟发性死亡,提前2天的3min缺血预处理可以防止这种死亡的发生,说明缺血预处理能够诱导脑缺血耐受从而保护神经元免受缺血打击的影响。2缺血预处理可使大鼠海马CA1区及CA3区锥体神经元磷酸化的p38 MAPK表达适度增多,该变化可能保护海马锥体神经元使其能够耐受之后的缺血打击。3缺血打击可使海马CA1区p-p38 MAPK的表达大量增多,提示p-p38 MAPK的过度表达可能参与脑缺血损伤机制。4提前2d的3min缺血预处理可以防止间隔2d后8min缺血打击引起的p-p38 MAPK过量表达,从而对神经元产生保护作用。5海马CA3区p-p38 MAPK的表达没有CA1明显,且阳性标记物的激活时间滞后,说明CA3区对该缺血的反应性不如CA1区强烈。