论文部分内容阅读
春化阶段是小麦生长发育进程中一个及其关键的时期。本研究从不同春化发育特性小麦辽春10和京841春化响应转录组Illumina高通量测序结果中,筛选出2个强烈上调的ESTs CL13519、Unigene 1312和2个下调ESTs Unigene 4460、Unigene 20。以春性小麦辽春10和冬性小麦京841为材料,系统分析了4个候选ESTs在转录水平的序列差异及春化处理过程中的表达特性,利用病毒诱导的基因沉默技术进行基因功能验证;构建CL13519过表达载体,利用农杆菌介导法将重组载体导入拟南芥中,分析转基因材料的生长发育特性。主要研究结果如下:1、以春性品种辽春10号和冬性品种京841为材料,克隆并分析4个ESTs的序列差异。结果显示:CL13519长1010 bp,ORF长681 bp,编码226个氨基酸,与Ta HOX1（Gen Bank:JQ915062.1）相似度87.49%;Unigene1312长度为479 bp,ORF全长282 bp,5′UTR 169 bp,3′UTR 26 bp,编码93个氨基酸,与硬质四倍体小麦脱水素（Gen Bank:X78432.1）一致性高达85%;Unigene4460长361bp,经TAIR在线分析,可能与H3蛋白甲基化相关;Unigene20长632 bp,与中国春3B染色体上一段序列（Gen Bank:HG670306.1）相似度高达83.91%,与山羊草hypothetical protein F77532582序列（Gen Bank:KD510223.1）相似度达77.15%。2、利用实时荧光定量PCR分析了4个ESTs在不同春化特性小麦中的表达特性,结果表明:CL13519、Unigene1312在辽春10号中表达量呈抛物线型表达,第5周时表达量达到最大值;Unigene1312在京841中的表达量呈抛物线型表达,第5周时表达量达到最大值;CL13519在京841中表达模式中有两个峰值,最大值出现在春化处理第五周;Unigene4460在辽春10号中表达量呈波动式下调表达;Unigene4460在京841中第1周急剧升高后急剧下降之后一直下调表达;Unigene20在辽春10号和京841中均呈波浪型表达,在第5周时表达量最低。3、以辽春10号为试验材料,利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）,成功构建了小麦VIGS基因功能验证的技术体系,并对所挑选的4个ESTs进行验证分析。结果显示:BSMV的侵染对小麦植株幼穗的分化进程产生了一定的影响。本试验中空白对照组、阴性对照组、阳性对照组之间小麦幼穗分化几乎无差异,BSMV:CL13519、BSMV:Unigene1312、BSMV:Unigene20幼穗分化发育晚于对照,而BSMV:Unigene4460侵染却加速了幼穗分化。4、以pCAMBIA3301为表达载体成功构建CL13519过表达载体,并通过农杆菌介导法对拟南芥进行转化,通过标记基因进行除草剂抗性筛选以及PCR鉴定,得到阳性转基因T1代植株,经分析发现T1代转基因植株营养生长、生殖生长早于野生型植株。