肝癌是世界上致死率较高的疾病之一。肝癌的发生是一个多分子介导的过程。现阶段,多项研究致力于探究肝癌发生的分子机理。除了体外不同的癌细胞系之外,在体内水平上常用来研究肝脏肿瘤发生的动物模型有大鼠、小鼠和斑马鱼等等。科研工作者在药物诱导的大鼠、异种移植癌细胞的裸鼠及转基因的小鼠和斑马鱼中探究肝癌发生的分子机理。然而,由于这些动物寿命较长,利用它们进行自发肿瘤方面的研究还比较少。贡氏假鳃鳉(Nothobranchius guentheri)的平均寿命为12个月,是一种常用来研究衰老的短寿命的脊椎动物模型。我们之前的研究揭示贡氏假鳃鳉肌肉中氧化损伤的水平和皮肤中β半乳糖苷酶的活性随老化逐渐升高。近些年来在贡氏、弗氏和高氏假鳃鳉中的研究表明假鳃鳉正在成为一种研究自发肿瘤的动物模型。但是这些研究只是探究了不同组织器官在不同发育时期的肿瘤发生率,具体的分子机理尚不清楚。因此本文将利用贡氏假鳃鳉探究肝脏自发肿瘤发生的分子机理。白藜芦醇是一种存在于多种植物中的多酚类化合物。在不同细胞和生物体中,白藜芦醇均可发挥抗氧化、抗炎症、抗衰老和抗肿瘤的作用。SIRT1是一种组蛋白依赖的去乙酰化酶,作为SIRT1的活化剂,白藜芦醇可通过SIRT1发挥其抗氧化、抗衰老和抗肿瘤的作用。然而,有关白藜芦醇抗癌症的研究主要是在体外癌细胞、药物诱导癌症的大鼠、异种移植癌细胞的裸鼠或转基因的动物模型中进行的,利用它对自发肿瘤发生机理的研究还比较少见。因此,本文中利用一年生的贡氏假鳃鳉作为实验对象,总共362条鱼(对照组和处理组各181条鱼),用来探究白藜芦醇对老化诱导的肝脏自发肿瘤的影响及其分子机理。由于贡氏假鳃鳉的平均寿命是12个月,这里我们分别选取6、9和12月龄的鱼代表青年、中年和老年。待贡氏假鳃鳉生长至性成熟时,我们随机地将其分为白藜芦醇处理组和对照组。实验组的鱼从4月龄开始喂食白藜芦醇,每天每条鱼约进食25μg的白藜芦醇,直至这些鱼生长至6、9和12月龄。在此三个不同的年龄阶段,我们分别通过实时定量PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测各组鱼的相对肝重、血清肝脏标志酶的活性、肝脏肿瘤的发生率、自发肿瘤的大小和恶化程度、细胞增殖和细胞凋亡以及SIRT1、PCNA、K-Ras、PI3K、p-AKT、Fox O1、Fox O3a、Ac-Fox O1、p-Fox O3a、DLC1、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3/7/9等蛋白的表达。我们的研究结果表明:1.白藜芦醇长期处理降低了相对肝重和血清肝脏标志酶的活性。与6月龄相比,贡氏假鳃鳉的肝重和相对肝重在9和12月龄显著升高;白藜芦醇在这两个阶段降低了肝重和相对肝重;白藜芦醇对两组鱼的体重并没有显著性的影响。与6月龄相比,9和12月龄血清中AST和ALT的活性显著升高,白藜芦醇缓解了这两种肝脏血清标志酶随老化的升高趋势。2.白藜芦醇降低了肝脏自发肿瘤的形成和生长。6月龄的贡氏假鳃鳉肝脏组织结构正常,并未出现自发肿瘤。贡氏假鳃鳉生长至9月龄时出现自发肿瘤。通过对30条9月龄和20条12月龄贡氏假鳃鳉肝脏组织进行切片,我们发现随着老化的进程,自发肿瘤的发生率逐渐升高,9月龄对照组的肿瘤发生率为86.67%,12月龄时接近100%;白藜芦醇处理后显著降低了肿瘤发生,9和12月龄肝脏中肿瘤的发生率分别降至60%和80%。白藜芦醇还抑制了自发肿瘤的生长,减小了肿瘤的体积,延缓了肿瘤的恶化程度。在肝脏自发肿瘤中,突变p53染色呈阳性,这表明贡氏假鳃鳉肝脏中的这些肿瘤结节为恶性肿瘤;白藜芦醇长期处理降低了突变p53的蛋白水平。3.白藜芦醇提高了肝脏中SIRT1的表达。利用三个不同发育阶段的贡氏假鳃鳉,我们首次发现,肝脏中SIRT1的表达在老化的过程中逐渐下降。白藜芦醇处理会缓解年龄诱导的SIRT1的下降趋势,在6、9和12月龄时都显著提高了SIRT1的表达水平。对照组鱼的肝脏部分肿瘤结节中SIRT1表达水平下降;而白藜芦醇处理后,肿瘤结节中SIRT1的表达有所提升。这表明在贡氏假鳃鳉中SIRT1可以作为一种抑癌因子。4.白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制K-Ras/PI3K/AKT途径降低肝脏肿瘤中的细胞增殖。在9和12月龄时,通过对增殖标志PCNA的检测,我们发现白藜芦醇抑制了贡氏假鳃鳉肝脏自发肿瘤中的细胞增殖。在此两个阶段,白藜芦醇还降低了K-Ras、PI3K和p-AKT的蛋白水平。贡氏假鳃鳉肝脏中两种内源性蛋白SIRT1和K-Ras相互作用,形成蛋白复合体。在12月龄时,白藜芦醇还通过SIRT1去乙酰化酶降低肝脏中K-Ras的乙酰化水平。因此我们推测,白藜芦醇是通过上调SIRT1的表达来降低K-Ras的乙酰化水平,下调K-Ras/PI3K/AKT信号通路,进而抑制肝脏自发肿瘤中的细胞增殖。白藜芦醇通过SIRT1及其介导的翻译后修饰抑制细胞增殖来降低自发肿瘤的形成和生长。5.白藜芦醇通过SIRT1调节Fox Os和DLC1介导的信号通路促进肝脏自发肿瘤中的细胞凋亡。在6月龄时,两组鱼的肝细胞基本不发生凋亡。在9和12月龄时,对照组细胞凋亡比率分别是0.216%和1.497%,处理组凋亡细胞的比率分别是1.630%和3.965%;在9和12月龄时,白藜芦醇显著提高了肝脏组织中细胞凋亡的比率。在12月龄时,白藜芦醇处理组肝脏细胞的凋亡主要发生在自发肿瘤处;而在对照组中,肿瘤部位的肝细胞并未发生细胞凋亡。在12月龄时,白藜芦醇降低了贡氏假鳃鳉肝脏中Fox O1和Fox O3a的表达,也降低了Fox Os的翻译后修饰(Ac-Fox O1和p-Fox O3a)水平。在9和12月龄时,白藜芦醇显著提高了DLC1的表达。在贡氏假鳃鳉肝脏中,内源性的DLC1与SIRT1相互结合形成蛋白复合体,而且白藜芦醇促进这两种蛋白的结合。在9月龄时,白藜芦醇降低了DLC1的磷酸化水平。在12月龄时,白藜芦醇显著上调了促凋亡蛋白(Bax和cleaved caspase-3,7,9)的表达,下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。我们推测在贡氏假鳃鳉中,白藜芦醇可通过SIRT1介导的翻译后修饰调节Ac-Fox O1和p-Fox O3a的表达水平,通过提高DLC1的表达及其与SIRT1的相互作用,上调促凋亡蛋白的水平,进而诱导肝脏自发肿瘤中的细胞凋亡。总之,在6月龄时贡氏假鳃鳉的肝脏中并未出现自发肿瘤,而我们在9月龄的贡氏假鳃鳉肝脏中发现了自发肿瘤,且此发生率在12月龄接近100%。贡氏假鳃鳉中年龄依赖的肿瘤发生率的升高趋势,可能是由于SIRT1表达随年龄下降导致的。白藜芦醇长期处理提高了SIRT1的表达并降低了肝脏中自发肿瘤生长。白藜芦醇通过SIRT1介导的翻译后修饰调节K-Ras/PI3K/AKT信号途径进而抑制肝脏自发肿瘤的增殖。白藜芦醇通过SIRT1调节Fox Os的翻译后修饰,上调SIRT1与DLC1的相互结合,改变Bcl-2家族蛋白的表达水平,进而在贡氏假鳃鳉的肝脏自发肿瘤中促进细胞凋亡。在贡氏假鳃鳉中,白藜芦醇长期喂食处理通过SIRT1介导的翻译后修饰抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来降低肝脏中自发肿瘤的形成和生长。我们的这些结果表明SIRT1在抑制自发肿瘤形成和发展过程中的重要作用,也证实了一年生的贡氏假鳃鳉的确是一种可用于自发肿瘤相关研究的良好的脊椎动物模型以及白藜芦醇可以作为一种潜在的天然药物来治疗肝脏自发肿瘤。