猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）主要引起初孕母猪繁殖障碍性疾病,临床表现为流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等特征。研究证实,猪胎盘滋养层细胞（porcine placental trophoblast cells,PTCs）是PPV致病的主要靶细胞,PTCs的功能异常和死亡与繁殖障碍密切相关。近年来,大量研究证实多种病毒的感染、致病与宿主细胞自噬密切相关,但PPV是否诱导宿主细胞自噬,以及PPV及其非结构蛋白在宿主细胞自噬过程中的作用及机制,迄今未见报道。本论文首先以PPV感染PTCs,检测了PPV感染后细胞自噬的水平和特征,进一步探讨了PPV诱导细胞自噬的信号转导通路,以及细胞自噬对PPV复制的影响,最后,系统研究了PPV非结构蛋白NS1和NS2及其宿主互作蛋白在细胞自噬过程中的作用和机制。研究取得以下结果:1. 以PPV感染PTCs,于感染后不同时间点检测细胞自噬水平,western blotting结果显示,与Mock组相比,PPV感染PTCs 12 h后自噬标志分子LC3Ⅱ开始增加,并在感染的24 h、36 h和48 h均显著高于Mock组（p<0.05）。荧光显微镜检测结果显示,PPV感染24 h的PTCs中存在大量代表自噬体的GFP-LC3荧光聚集点。透射电镜观察细胞超微结构显示,PPV感染24 h的PTCs中存在具有双层膜的自噬体囊泡结构。利用自噬流抑制剂CQ和BAF预处理细胞,然后用PPV感染细胞,western blotting结果显示,PPV感染组细胞中LC3Ⅱ水平显著高于Mock组（p<0.05）。对PPV感染48 h内细胞自噬特征进行检测,western blotting结果显示,随着PPV感染时间的延长,细胞中p62累积增加直至48 h开始下降。激光共聚焦检测结果显示,PPV感染24 h的PTCs中存在大量代表自噬体的RFP⁺GFP⁺-LC3黄色荧光聚集点,而阳性对照组（EBSS诱导细胞完全自噬）存在大量代表自噬溶酶体的RFP⁺GFP^--LC3红色荧光聚集点,并且,PPV感染组PTCs中大量LC3不能与LAMP1共定位,而EBSS处理组LC3能与LAMP1共定位,证明PPV感染48 h内主要诱导细胞发生不完全自噬。进一步运用激光共聚焦检测PPV感染PTCs 24 h、48 h、72 h后自噬体和自噬溶酶体的形成情况,结果显示,在PPV感染24 h和48 h细胞中存在大量代表自噬体的RFP⁺GFP⁺-LC3黄色荧光聚集点,但是随着感染时间延长,在PPV感染72 h细胞中则存在大量代表自噬溶酶体的RFP⁺GFP^--LC3红色荧光聚集点。以上研究结果表明,PPV感染诱导PTCs自噬,在感染的早期（24 h和48 h）主要诱导自噬体的形成,细胞发生了不完全自噬,在感染的后期（72 h）进一步诱导了自噬流的形成,细胞发生了完全自噬。2. 以PPV感染PTCs,western blotting检测细胞自噬相关信号分子,结果显示,PPV感染6 h、12 h、24 h细胞中p-m TOR表达水平均显著低于Mock组（p<0.05）,PPV感染PTCs 6 h后Beclin 1表达水平开始升高,并持续至感染24 h（p<0.01）,提示m TOR可能参与调控PPV诱导的细胞自噬。进一步检测结果显示,m TOR激活分子Rheb能够显著抑制PPV感染引起的自噬相关分子Beclin 1和LC3Ⅱ的表达量升高（p<0.01）。以m TOR上游各信号通路特异性抑制剂处理细胞,western blotting检测各抑制剂对PPV感染细胞中LC3Ⅱ的影响,结果显示,p53、PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2信号通路抑制剂对PPV感染细胞中LC3Ⅱ水平无明显影响（p>0.05）,而AMPK特异性抑制剂Compound C明显降低了PPV感染细胞中LC3Ⅱ水平（p<0.01）。进一步检测结果显示,PPV感染可引起PTCs中磷酸化Raptor水平升高,且AMPK特异性抑制剂Compound C处理能减弱由PPV引起的Raptor磷酸化水平升高。分别以PPV感染野生型和AMPK敲除(AMPK^-/-)的PTCs,western blotting结果显示,AMPK^-/-细胞中Raptor磷酸化水平降低,Beclin 1和LC3Ⅱ表达水平下降。研究结果表明,PPV感染通过激活AMPK/Raptor信号通路,抑制m TOR活化进而启动细胞自噬。3. 以PPV感染用自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）预处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,RAPA处理组细胞中LC3 II（0,12 h）表达水平、NS1表达水平和PPV DNA拷贝数高于对照DMSO组（p<0.01）。以PPV感染自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）预处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,3MA处理组细胞中LC3 II表达水平,NS1表达水平和PPV DNA拷贝数低于对照DMSO组（p<0.05）。以PPV感染用ATG5特异性干扰RNA（si ATG5）处理的PTCs,western blotting和real time Q-PCR检测结果显示,si ATG5组细胞中LC3 II表达水平,NS1表达水平和PPV DNA拷贝数低于阴性干扰RNA对照组（si NC）（p<0.05）。研究结果表明利用自噬诱导剂诱导细胞自噬能增加PPV在细胞中的复制水平,利用自噬抑制剂或下调ATG5抑制细胞自噬能降低PPV在细胞中的复制水平。4. 利用紫外灭活的PPV（UVPPV,失去复制能力,但含有PPV结构蛋白）感染PTCs,western blotting结果显示,UVPPV感染细胞中随着感染剂量的增加和感染时间的延长LC3Ⅱ呈上升趋势,p62蛋白水平在感染24 h开始下降,并在36 h、48 h持续下降;自噬流抑制剂CQ和BAF处理组的UVPPV感染细胞中LC3Ⅱ和p62水平显著高于未处理组（p<0.05）;激光共聚焦结果显示,在24 h.p.i.,UVPPV感染细胞中有大量的RFP⁺GFP^--LC3红色荧光聚集点,说明UVPPV能诱导自噬溶酶体形成。分别以PPV的非结构蛋白NS1、NS2转染PTCs后,再以UVPPV感染,western blotting结果显示,过表达NS1明显抑制了UVPPV感染细胞中p62的降解。NS1梯度转染后以UVPPV感染PTCs,western blotting和激光共聚焦检测结果显示,随着NS1转染量的增加,细胞内p62逐渐积累增多,细胞中自噬体（RFP⁺GFP⁺-LC3黄色荧光聚集点）增加,自噬溶酶体形成减少。上述结果表明,PPV NS1能够抑制UVPPV诱导的完全自噬,提示PPV NS1在PPV诱导PTCs不完全自噬中发挥关键作用。进一步在NS1定量转染的细胞中,以NS2梯度转染后再以UVPPV感染,激光共聚焦检测显示,在NS1单转染的细胞中,UVPPV感染后主要诱导自噬体（RFP⁺GFP⁺黄色荧光聚集点）的形成,但随着NS2转染量的增加,细胞内自噬溶酶体（RFP⁺GFP^-红色荧光聚集点）形成逐步增加。以上研究结果表明,UVPPV感染诱导PTCs形成完全自噬,NS1在PPV诱导细胞形成不完全自噬中发挥重要作用,而NS2在诱导细胞不完全自噬向完全自噬转化过程中发挥关键作用。5. 通过IP串联质谱法筛选NS1的宿主互作蛋白,CO-IP和GST-pull down鉴定出RAB2A是NS1的直接互作蛋白。进一步鉴定RAB2A和NS1的互作方式,CO-IP和激光共聚焦鉴定结果显示,在PPV感染过程中NS1能与RAB2A互作,NS1和RAB2A存在共定位,NS1 N端1 aa～86 aa（NS1与NS2的共有区域）能与RAB2A共定位;等温滴定量热法检测结果显示,NS1 N端1 aa～86 aa能与RAB2A直接互作。对NS2与RAB2A的相互作用鉴定,激光共聚焦检测结果显示NS2和RAB2A存在共定位。通过IP串联质谱法筛选NS2的宿主互作蛋白,再通过CO-IP和GST-pull down鉴定出VAMP7是NS2的直接互作蛋白。进一步鉴定VAMP7和NS2的互作方式,CO-IP和激光共聚焦鉴定结果显示,在PPV感染过程中NS2能与VAMP7互作,NS2和VAMP7存在共定位,NS2 87 aa～161 aa与VAMP7存在共定位;等温滴定量热法检测结果显示,NS287 aa～161 aa能与VAMP7直接互作。6. 对RAB2A和VAMP7相互作用进行鉴定,CO-IP结果显示,UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7发生了互作,转染NS1抑制了RAB2A与VAMP7的互作;激光共聚焦检测结果显示,UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7存在共定位,转染NS1后RAB2A与VAMP7不能共定位。对PPV感染过程中RAB2A和VMP7的互作进行鉴定,激光共聚焦检测结果显示PPV感染早期（24 h）RAB2A不能与VAMP7共定位,PPV感染后期（72 h）RAB2A能与VAMP7共定位,虽然转染NS1抑制了UVPPV感染细胞中RAB2A与VAMP7的共定位,但在此基础上转染NS2又使RAB2A能与VAMP7共定位。NS2能与RAB2A和VAMP7共定位。进一步通过CO-IP和激光共聚焦技术对NS1、NS2与RAB2A的互作区域进行筛选鉴定,结果显示,NS1、NS2的1aa～43 aa是其与RAB2A的互作区域,其中-10EVLK14-位点是相互作用所必需的。构建-10EVLK14-位点突变的突变毒株△NSPPV,real time Q-PCR检测结果显示,72 h.p.i.△NSPPV在PTCs中病毒拷贝数低于PPV野生型病毒（p<0.05）;western blotting和激光共聚焦检测结果显示,△NSPPV感染诱导细胞中LC3Ⅱ水平升高,感染早期和后期细胞中均形成大量自噬溶酶体。上述研究结果表明PPV NS1通过N端的1 aa～43 aa共有区域与宿主蛋白RAB2A直接互作,抑制RAB2A与VAMP7互作介导的自噬体与溶酶体融合,从而在PPV感染早期诱导细胞形成不完全自噬中发挥重要作用。PPV NS2既与RAB2A互作,也与VAMP7互作,促进RAB2A与VAMP7互作介导的自噬体与溶酶体融合,从而在PPV感染后期（72 h）诱导细胞由不完全自噬向完全自噬转化。本研究发现,PPV感染早期（24 h和48 h）主要诱导PTCs形成不完全自噬,后期（72 h）主要诱导细胞形成完全自噬。阐明了PPV通过激活AMPK/m TOR信号通路诱导PTCs自噬的分子机制。进一步研究发现PPV感染通过诱导细胞自噬促进其自身复制。本研究还发现,在PPV感染早期非结构蛋白NS1通过与宿主蛋白RAB2A互作进而阻止自噬体与溶酶体的融合,细胞发生不完全自噬。在感染后期非结构蛋白NS2通过与NS1、宿主蛋白RAB2A和VAMP7互作进而介导自噬体与溶酶体的融合,促进细胞发生完全自噬。鉴定出PPV非结构蛋白NS与RAB2A互作的关键位点（10EVLK14）,并获得了诱导细胞完全自噬、且复制能力和致病能力低于野生型PPV的突变毒株（△NSPPV）。本论文研究结果阐明了PPV及其非结构蛋白NS1、NS2在诱导PTCs自噬过程中的作用和调控机制,为进一步揭示PPV的致病机制提供依据。