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BMP-7对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及对核因子-κB p65核转移的影响前言近年研究发现，临床急性缺血性心脏疾病再灌注后加重缺血性损伤，甚至导致心肌梗死等病理改变。骨形态发生蛋白-7（BMP-7），即成骨蛋白-1（OP-1），是骨形态发生蛋白（BMPs）家族中的一员，从属于转化生长因子-β（TGF-β）超分子家族。BMP-7是一种较强的生物活性因子，是胚胎期器官发育的重要调节因子，并且在成年器官的修复和再生过程中发挥重要作用。新近研究表明，人成骨蛋白-1（hOP-1）可产生显著的抗缺血效应。本实验拟利用基因转染技术将重组鼠骨形态发生蛋白-7（rrBMP-7）基因转染心肌细胞，从细胞水平和器官水平探讨BMP-7基因和重组蛋白对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响及其机制，为缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。材料与方法实验动物：生后72h Wistar乳大鼠，雌雄不拘，由中国医科大学实验动物中心提供。心肌细胞的制备与培养：断颈法处死乳大鼠后无菌条件下摘取左心室，D-Hank’s液洗去残血，分离出附着组织，剪成1 mm3左右碎块。采用差速贴壁法制备心肌细胞。前36h培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷0.1mmol／L抑制非心肌细胞增殖。细胞爬片后以α-肌动蛋白免疫组化鉴定心肌细胞纯度为95％以上。培养成活3d的心肌细胞，传至35mm培养皿（含15％胎牛血清的DMEM培养基），使培养皿的细胞数在2×105个左右。实验一：随机分4组：pcDNA3.1-rrBMP-7质粒组（转染实验组）、pcDNA3.1组（空载体对照组）、FuGENE 6转染试剂对照组和细胞空白对照组。pcDNA3.1（+）-rrBMP-7构建后进行pcDNA3.1-rrBMP-7扩增、纯化和鉴定。将含pcDNA3.1-rrBMP-7基因的质粒2μl与FuGENE 6转染试剂98μl混合，室温下静置30min后将此混合物加入实验组细胞，37℃、5％CO2条件下培养箱中转染72h后观察BMP-7表达情况。空载体组转染只含pcDNA3.1的质粒；FuGENE 6转染试剂对照组细胞转染的混合物中不加质粒，加入等量PBS；细胞空白对照组细胞不加转染试剂，加入等量PBS。逆转录-PCR法检测转染rrBMP-7基因mRNA的表达。免疫细胞化学和Westem blot法检测BMP-7在心肌细胞中的表达。实验二：随机分为3组，正常对照组（C组）：未经缺血／再灌注处理；模拟缺血再灌注组（IR组）：培养的心肌细胞缺氧120min，复氧240min；基因转染组（BT组）：转染BMP-7基因后，再行缺氧120min／复氧240min。每组重复8次。模拟缺血再灌注组和基因转染组细胞吸去细胞培养液，换用95％N2+5％CO2混合气体饱和30min的无糖DMEM培养液2ml，置于缺氧罐中缺氧培养2h，复制“缺血”模型。再灌注期取出培养皿，培养液换用混合空气饱和的DMEM 2ml，放回5％二氧化碳孵育箱中继续培养4h。对照组细胞一直置于CO2培养箱中，基因转染组缺血／再灌注损伤处理前进行基因转染。心肌细胞搏动计数和观察形态学变化。采用台盼蓝排斥法检测心肌细胞存活率。应用流式细胞仪PI染色法和TUNEL法测定细胞凋亡率。测定心肌酶乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CPK）含量，丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。荧光成像系统测定细胞内钙离子浓度。免疫细胞化学和Western blot法检测NF-κB p65在心肌细胞核中的表达。以细胞核中出现棕黄色颗粒为NF-κB p65阳性结果。实验三：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，随机分为单纯缺血再灌注组（IR组），心肌缺血再灌注+BMP-7治疗组（B组）和假手术对照组（Sham组）。各组分设缺血30min后再灌注4h和24h时相点，Sham组只设4h时相点作总体对照；另用32只大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注+BMP-7治疗组，以行TTC染色测定心肌梗死范围。B组于再灌注前股静脉给予rhBMP-7 250μg／kg，Sham组和IR组给予等量生理盐水。于实验结束时取心腔内血检测LDH和CPK含量，心肌匀浆检测MDA含量、SOD活性，TTC法测定心肌梗死面积，HE和电镜下观察心肌组织学变化。TUNEL法测定细胞凋亡。免疫组织化学和Westem blot检测NF-κB p65在心肌细胞核中的表达。所有数据以平均数±标准差表示，使用SPSs 13.0统计软件进行方差分析，组间比较采用t检验，p＜0.05为有统计学意义。实验结果实验一：入门载体质粒pMD18-T Simple-BMP-7 DNA测序结果和Gene Bank中所提供的已知序列（XM342591）进行比对，结果表明，所克隆的BMP-7 cDNA从起始密码子到终止密码子共1293bp，与已知序列完全一致。将质粒pcDNA3.1-BMP-7用HindⅢ／BamHⅠ进行酶切检测，释放出5406bp载体片段和1293bp BMP-7片段。RT-PCR结果中，实验组出现471bp条带，表明实验组心肌细胞中有BMP-7基因在mRNA水平的表达；空载体组、FuGENE 6转染试剂对照组和细胞空白对照组则无相应条带出现。实验组转染质粒pcDNA3.1-BMP-7后，在心肌细胞胞质中有BMP-7表达，呈棕黄色。Westem blot检测到大小为18kD的特异性蛋白质条带。实验二：模拟缺血／再灌注组（IR组）的细胞存活率降低。基因转染组的细胞存活率明显高于缺血／再灌注组。与对照组相比，IR组搏动频率明显减慢，基因转染组搏动频率明显高于IR组。对照组可见小亚二倍体峰；IR组凋亡率明显增加。而BMP-7基因转染预处理则使细胞大部分存活，凋亡率明显低于IR组。心肌细胞再灌注后LDH、CPK和MDA含量较正常心肌细胞显著升高。BMP-7基因转染预处理后LDH活性较IR组明显降低。IR组SOD活性较正常对照组明显下降，BMP-7基因转染预处理后SOD活性均较IR组升高（P＜0.01）。细胞内钙离子测定结果显示，IR组[C22+]i浓度较正常对照组明显升高（P＜0.01），BMP-7基因转染预处理后[ca2+]i含量较IR组降低（p＜0.01）。IR组NF-κB p65核染色和蛋白积分光密度比与正常对照组相比显著性增高（P＜0.01）。BMP-7基因转染预处理后减少了NF-κBp65核染色和积分光密度比（P＜0.01）。实验三：心肌缺血／再灌注过程中各组MDA、SOD、LDH和CPK含量变化与Sham组相比，IR4h组和24h组的MDA、LDH和CPK含量均明显升高，SOD活性降低（P＜0.01），表明IR组心肌组织因缺血／再灌注损伤造成氧自由基和酶学的改变。B组MDA、LDH和CPK含量与IR组相比明显减少，与IR组比较差异有显著性（P＜0.01）；SOD较IR组明显恢复（P＜0.01）。与IR组同时点相比，B组梗死心肌重量（IS）及其占缺血危险区心肌重量百分比（IR／AAR％）均显著减少（P＜0.01）。电镜超微结构观察发现，Sham组心肌细胞超微结构未见明显异常；IR组心肌细胞超微结构损伤严重；与IR组比较，B组心肌细胞超微结构损伤均有不同程度的改善。TUNEL法测定细胞凋亡结果显示，与IR组相比，B组凋亡细胞明显减少。IR组NF-κB p65核染色和积分光密度比与正常对照组相比显著性增高（p＜0.01）；BMP-7基因转染预处理后减少了NF-κB p65核染色和积分光密度比（P＜0.01）。结论1、应用本文介绍的方法，成功地构建了BMP-7真核表达质粒并在心肌细胞中大量表达，为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。2、BMP-7转染可对抗缺氧复氧对心肌细胞的损伤，其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力，对抗缺氧复氧引起的细胞内钙超载有关。3、大鼠在体研究表明，rhBMP-7缩小梗死面积，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。可能与其抑制脂质过氧化，保护抗氧化酶活力有关，有望成为心肌再灌注疗法的辅助用药。4、细胞水平和在体水平研究都表明BMP-7可减少细胞凋亡的发生，其保护作用可能与抑制NF-κp65核转移有关。