背景：恶性肿瘤一直以来是严重危害人类健康的一类疾病，其中胃癌是世界第四大常见恶性肿瘤，其病死率高居第二位。肝癌预后非常差，每年约有63万新发病例，并造成约59万患者死亡，在所有恶性肿瘤导致的死亡中排第三位。在我国消化道肿瘤一直居于各种恶性肿瘤的首位，近年来尽管随着诊疗技术的不断进步，消化道肿瘤如胃癌、肝癌及结肠癌的诊断和治疗有了长足进步，但是多数患者发现肿瘤时，已经到了中晚期，预后往往不佳。因此，深入探讨一些消化道恶性肿瘤的发病机制，对于早期肿瘤的筛查和诊断，及时选择合适的治疗方案，以充分提高癌症患者生存率都起着决定性的作用。RNA编辑的定义是：DNA转录成RNA后，除了RNA剪切外的其他加工过程，它通过删除、添加以及修饰核苷酸等方式改变遗传信息。RNA编辑是国际上近年来一个活跃的前沿研究领域，对RNA起编辑作用的酶称为RNA编辑酶。现已发现的RNA编辑酶包括ADAR1、ADAR2和ADAR3，其中研究最多的是ADAR1。越来越多的研究认为RNA编辑与肿瘤、炎症的关系密切，可能部分参与了疾病发生机制。ADAR1在胃癌、结肠癌和肝癌等消化道恶性肿瘤及消化系统常见病如慢性肝炎、肝硬化发生发展中的作用国内外鲜有报道，尤其系统的研究与消化道肿瘤的关系方面还未见有报道。为了进一步研究ADAR1在胃癌、肝癌及结肠癌等恶性消化道肿瘤中的作用及内在机制，我们设计了该实验。目的：1.制备和纯化ADAR1多克隆抗体，为后续研究提供基础。2.探讨RNA编辑酶ADAR1在胃癌、肝癌、结肠癌及相应癌旁、正常组织中的表达及定位情况，分析ADAR1与上述肿瘤临床病理特征的关系。3.了解RNA编辑酶ADAR1在HBV+、HBV-慢性肝炎、肝硬化组织中的表达情况及定位。4.构建和鉴定ADAR1过表达慢病毒载体并包装、纯化慢病毒颗粒。稳定转染胃癌细胞系，为后续功能学的研究提供有力工具。方法：1.制备ADAR1抗原肽，免疫正常兔并收集、层析纯化抗体。2.应用免疫组织化学二步改良法（SP法）检测胃癌、肝癌、结肠癌和相应癌旁或正常组织以及在HBV+、HBV-慢性肝炎、肝硬化组织中的表达情况。3.分析以上肿瘤组织中ADAR1的表达与临床病理资料的相关性。4.设计并构建ADAR1的慢病毒过表达载体，用293T细胞系包装慢病毒颗粒，感染胃癌细胞系SGC-7901、MKN28，筛选获得稳定转染株。PCR和Western-Blot鉴定载体的有效性。结果：1.制备出高效价的多克隆抗体anti-ADAR1(N-端)和anti-ADAR1(C-端)。经ELISA检测抗体效价，兔血清（识别N端多肽）的抗体效价超过1:2000，效价很高。兔血清（识别C端多肽）的抗体效价超过1:64000，效价极高。这两个抗体针对不同的抗原表位（分别位于ARDR1的N端和C端），都具有很好的效价。2.胃癌和正常胃粘膜组织中ADAR1的定位与表达免疫组化检测ADAR1在246例胃癌组织中的表达情况，结果显示ADAR1主要定位于胃癌组织的胞浆，部分低分化弥漫型胃癌、未分化胃癌有胞核表达。ADAR1蛋白在胃癌与正常胃粘膜组织中阳性表达率分别为96.7％(238/246)和100％(134/134)，其中分别有48.3％(119/246)和89.6％(120/134)表达呈强阳性。比较ADAR1在胃癌和正常胃粘膜组织中的表达，差异具有统计学意义(P<0.001)。进一步分析ADAR1与胃癌临床病理参数间的关系，我们发现其表达阳性率与组织分化、TNM病理分期有关（P<0.05）。分化程度上以高分化组阳性率为最高，明显高于中、低及未分化组（P<0.001），且表达强度随组织分化的降低而降低。TNM分期中I、II期阳性表达率为100%（129/129)，III、IV期的阳性表达率为93.2%（109/117)，I、II期阳性表达率明显高于III、IV期，差异比较具有统计学意义(P<0.001)。另外检测ADAR1在40例胃癌组织中的表达阳性率为95%（38/40），在与其对应的淋巴结转移灶中阳性率为92.5%（37/40），经统计分析，ADAR1在胃癌与其对应淋巴结转移灶中的表达无显著统计学差异（P>0.05）。3.在肝癌、癌旁组织，慢性肝炎以及肝硬化组织中ADAR1的定位和表达在98例肝癌及其相匹配的癌旁组织中，ADAR1均分布于肝癌组织的胞浆。其蛋白表达率分别为87.8％(86/98)和98％(96/98)，阳性率有统计学差异(P<0.001)。另检测140例肝癌组织，结果表明ADAR1蛋白表达阳性率与组织分化、TNM病理分期有关（P<0.05），而与性别、年龄无关（P>0.05）。ADAR1的表达强度随组织分化的降低而降低（P<0.01），TNM分期中以I、II期阳性表达率为高，与III、IV期比较有统计学意义（P<0.05）。该蛋白在慢性肝炎、肝硬化组织中的表达定位于细胞浆，其中29例HBV+慢性肝炎及35例HBV-肝炎中表达率分别为93.1％(27/29)和97.1％(34/35)，阳性率无统计学差异(P>0.05)。在59例HBV+肝硬化及33例HBV-肝硬化中表达率分别为86.4％(51/59)和75.8％(25/33)，阳性率也无统计学差异(P>0.05)。按是否考虑HBV阳性、阴性因素，比较肝炎、肝硬化两者之间表达情况也均无统计学意义。4. ADAR1在结肠癌及其配对癌旁组织中的定位与表达ADAR1蛋白在100例结肠癌及其相匹配的癌旁组织中的表达结果表明，ADAR1主要定位于细胞质。结肠癌及其相匹配的癌旁组织阳性表达率分别为88％(88/100)和98％(98/100)，两者有统计学差异(P<0.001)。在结肠癌组织中ADAR1蛋白表达阳性率与性别、年龄、TNM病理分期无关（P>0.05），而与组织分化有关（P<0.05），其表达强度随组织分化的降低而降低。5.建立了ADAR1慢病毒表达系统我们分别构建并鉴定了ADAR1的过表达载体pGC-LV/ADAR1P110、pGC-LV/ADAR1P150，包装病毒颗粒使用293T细胞系，并瞬时感染293T细胞，采用Q-PCR进行病毒滴度测定及mRNA水平的初步验证。在证实以上表达系统成功建立的基础上，利用该系统进一步建立稳定表达ADAR1-P110和ADAR1-P150两个亚型和空载体对照的SGC-7901、MKN28胃癌细胞株。结论：在本实验中，我们成功制备出效价高，敏感性强的ADAR1抗体，并首次将其用于消化道肿瘤的表达研究，本实验所检测病例均使用组织芯片，数量充足，保证了试验在同等条件下进行，结果相对可靠。我们的研究表明，ADAR1在消化道恶性肿瘤胃癌、肝癌、结肠癌中的表达阳性率低于相对应的正常组织及癌旁组织，且肿瘤的表达与年龄、性别无关，而与TNM分期和组织学类型密切相关。这一研究结果提示我们ADAR1在胃癌、肝癌、结肠癌的发生发展中可能发挥抑癌基因的作用，RNA编辑酶ADAR1可能参与了胃癌、肝癌、结肠癌的发生发展过程。进一步研究以上三个肿瘤RNA的异常编辑以及与癌基因和抑癌基因表达的相互关系，并寻找RNA异常编辑的下游作用底物和上游调控分子，将有助于我们提高对部分消化道肿瘤发生发展过程的认识。为此我们成功设计并构建ADAR1的慢病毒过表达载体，该表达系统经测序及Western blot验证后，包装成慢病毒颗粒并稳定转染胃癌细胞系。