糖基化酪蛋白的制备、及其性能和应用研究

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天然酪蛋白(Casein,Cas)是公认的绿色安全,且具有较高营养价值的良好材料,常被应用于输送疏水性营养物质,从而可以改善其溶解性,乳化稳定性,提高生物利用率。因具有良好的应用前景而备受关注。因由于其pH在等电点附近,基本不溶于水溶液,阻碍了其在食品领域上的发展前景。美拉德反应(Maillard reaction)是能有效改善蛋白质功能特性,与其他改性方法相比,该方法存在较少的安全问题,可以有效地避免合成化学试剂和有机溶剂的使用。本论文基于不同反应条件对接枝产物的接枝度、褐变程度及溶解性和乳化性能的影响,选择合理工艺条件下性能优异的接枝产物。并采用多种分析手段探讨了接枝反应对酪蛋白-多糖共价复合物理化性质和结构特征的影响。同时采用超声分散法制备了共聚物自组装纳米粒,并研究了纳米粒的组装机理和稳定性,最终以作为运送载体将辣椒红色素(PRP)胶囊化,并模拟体外胃肠液消化模型研究纳米胶囊对PRP控制释放效果。首先以Cas为基本壁材,与具有优良性能的2种多糖:卡拉胶(Carrageenan,Ca)、羧甲基壳聚糖(CarboxymethylChitosan,CC)。利用超声Maillard干热反应进行接枝。制备出2种性能较优的酪蛋白-多糖共价复合产物,即糖基化酪蛋白:酪蛋白-卡拉胶(Cas-Ca)、酪蛋白-羧甲基壳聚糖(Cas-CC)。探索了底物配比、相对湿度,反应温度及时间等因素对酪蛋白与多糖接枝程度的的影响。从而确定最佳制备工艺为:Cas-Ca与Cas-CC最佳底物配比分别为1:2和1:3,反应时间分别为24 h和36 h,反应温度均为60℃,反应湿度为79%。所得两种产物最佳接枝率可达到78.05%和79.84%。SDS·PAGE图谱结果分析显示:在超声干热处理的条件下,酪蛋白多糖共聚物形成,原蛋白条带消失,出现大分子量蛋白条带;同时红外光谱及荧光分析印证了 SDS·PAGE图谱的结论,证实两者确实发生了美拉德反应,经干法改性生成了糖基化共聚物,热重分析结果证明接枝后的产物相对于原蛋白,其热稳定性有明显的提高。在超声的条件在,促进糖基化酪蛋白自发形成纳米粒,通过改变盐离子、乙醇等的浓度探索了其组装机理,并以粒径大小和分布系数(PDI)为参数,研究环境因素对纳米粒稳定性的影响;机理研究证明酪蛋白多糖共价产物在超声分散过程中依靠疏水作用力,氢键以及离子键形成了紧密的纳米球形结构,因此有良好的热稳定性、肠胃稳定性、冻干稳定性和储存稳定性。Cas-Ca和Cas-CC均能有效包埋辣椒红色素(PRP),包封率分别达87.3%和82.5%,且载有辣椒红色素的纳米胶囊的平均粒径分别为 319.1-371.2 nm 和 309.5-385.8 nm,粒径分布系数均在 0.15-0.37 之间。分别将PRP和PRP纳米胶囊放置在不同环境条件下贮藏6周后通过测量计算观察其保留率的变化,来测定糖基化酪蛋白纳米胶囊对PRP的保护效果。结果显示两种共价产物均能有效保护PRP,有效降低了环境因素对其的影响。在室外光照的条件储存6周后,载有辣椒红色素的两种共聚物(Cas-Ca-PRP纳米胶囊/Cas-CC-PRP纳米胶囊)的保留率分别为82.1%和83.3%,而在室内温度25℃条件下放置6周后测量其保留率,结果分别为83.3%和85.8%,在4℃条件下保留率分别可达到为89.2%和90.5%。加入苯甲酸钠和山梨酸钾的PRP纳米胶囊,其保留率也并没有发生明显变化,这种保护作用是由于糖基化酪蛋白与PRP结合后,内核的PRP是被保护起来,因而降低了 PRP与外界发生化学反应。同时Cas-Ca/Cas-CC作为运输载体,在胃液中可有效保护PRP不被胃蛋白酶消化,在肠液中可有效控制释放。因蛋白表面接上良好水溶性的多糖,糖链形成外壳,而疏水部分被包裹在核内。此结构可以有效包埋PRP,并提高其在水中的溶解,因改性壁材良好的稳定性,可对保护核内有效物质不易受外界环境的影响。模拟胃液中,Cas-Ca-PRP纳米胶囊/Cas-CC-PRP纳米胶囊在3 h内均释放量少,其中的PRP仍能与糖基化酪蛋白有效结合,维持分散状态,从而有利于其进入肠道完成释放与乳化;模拟肠液中,共聚物胶束在在1h内对PRP存在明显突释现象,两者最终释放总量分别达到76.6%和78.6%,有效提高了 PRP的生物可给性。
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