近年,我国结直肠癌发病率和死亡率有持续上升趋势,发病人群趋于年轻化,结直肠癌正成为威胁我国民众健康的重要恶性肿瘤。结肠癌的早期症状不明显,大部分患者也没有癌症早期筛查的习惯,患者确诊时多为中晚期,预后较差。目前结肠癌治疗的主要手段为手术、化疗和放射治疗。尽管治疗模式有所优化,但是结肠癌患者的预后仍有改善的空间,例如部分结肠癌患者有放疗不敏感甚至完全抵抗的问题。因此寻找结肠癌新的预后标志物,探索放射敏感性新的分子机制,将有助于进一步改善结肠癌患者的预后。核仁小RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）可在各种疾病中充当新型调控RNA,尤其在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。近年来,有关snoRNA在肿瘤中作用的报道日益增多,并逐渐成为肿瘤领域新的研究热点。探索snoRNA在肿瘤中的生物学功能与机制,可为肿瘤患者提供新的预后标志物以及新的潜在治疗靶点。放射治疗是结肠癌治疗的重要手段之一,而部分结肠癌患者对放疗不敏感甚至是完全抵抗,这也是制约结肠癌患者进一步改善预后的重要因素。目前,snoRNA在肿瘤放射敏感性中作用的研究仍处于起步阶段,尚未有研究报道snoRNA参与肿瘤细胞的放射敏感性调控,因此有必要对这一领域进行进一步的探索。课题组前期通过小鼠模型筛选潜在辐射响应的人鼠同源snoRNA,联合结肠癌与癌旁正常组织snoRNA芯片的结果,鉴定出两条在结肠癌中可能具有重要调控功能的snoRNA（SNORD18B和SNORD18C）,但调控效应与机制不明。本研究通过临床数据库调研、体内外功能学实验、高通量测序以及生物信息学分析等技术,在临床水平证实SNORD18B和SNORD18C具有结肠癌诊断与预后评估作用,在分子、细胞、动物水平证实SNORD18B和SNORD18C对结肠癌细胞生长与放射敏感性的调控作用,并对其调控机制进行了进一步探索,为结肠癌的诊断、预后及放射敏感性评估提供了一个新的潜在生物标志物,同时为结肠癌的治疗提供了新的潜在靶点。SNORD18B和SNORD18C在结肠癌中功能与机制的研究也将为癌症的发生发展提供新的理论。本研究分四部分探讨SNORD18B/18C对结肠癌细胞生长及放射敏感性的调控作用与机制。第一部分SNORD18B/18C在结肠癌组织和细胞株中的表达情况及其临床意义目的:筛选具有结肠癌诊断、预后及放射敏感性评估作用的snoRNA,并对其在结肠癌细胞系和结肠癌标本中的表达情况和临床价值进行初步探索,为进一步研究该snoRNA的功能与机制提供依据。方法:通过qPCR方法验证课题组前期研究中发现的潜在辐射响应人鼠同源基因snord18b和snord18c的辐射响应情况。收集25例结肠患者癌组织与癌旁正常组织的病理标本以及不同的结肠癌细胞株,采用qPCR检测SNORD18B和SNORD18C的表达情况,并通过接受者操作特性曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）分析SNORD18B和SNORD18C的表达水平能否作为结肠癌患者的潜在诊断生物标志物。获取癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中有关结肠癌患者SNORD18B和SNORD18C的表达情况以及患者临床病理特征、预后等数据。采用卡方检验分析SNORD18B和SNORD18C的表达与结肠癌患者临床病理特征之间的相关性。采用Spearman相关性分析评价SNORD18B与SNORD18C的相关性。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,利用风险比例回归模型（Cox回归模型）进一步分析这两个snoRNA与患者预后之间的关系。结果:qPCR验证结果显示,与未照射组相比,snord18b和snord18c在实验组的表达呈现显著上调,且在0.5Gy×1次组中上调更为明显。结肠癌临床样本及结肠癌细胞系的qPCR结果显示,结肠癌组织SNORD18B和SNORD18C的表达均明显高于结肠正常黏膜组织,结肠癌细胞株HCT116、SW620及HT29中SNORD18B和SNORD18C的表达也高于正常结肠细胞FHC。ROC曲线分析显示,SNORD18B和SNORD18C的表达水平均能区分癌旁正常组织和结肠癌组织。卡方检验结果表明,SNORD18B的表达水平与患者的年龄、淋巴管侵犯、血管侵犯以及结肠息肉病史显著相关,而SNORD18C的表达水平仅与患者的淋巴管侵犯以及结肠息肉病史显著相关。Spearman相关性分析显示,SNORD18B与SNORD18C的表达具有高度一致性,即高表达SNORD18B的患者,通常也高表达SNORD18C,且二者的表达也显著相关。而Kaplan-Meier生存分析显示,SNORD18B和SNORD18C高表达的患者都具有更差的预后,当患者的SNORD18B和SNORD18C共同高表达时,其预后最差。最后,Cox回归模型分析显示,患者的年龄、TNM分期、SNORD18B高表达、SNORD18C高表达以及SNORD18B/18C共同高表达是结肠癌患者的独立预后因素。小结:（1）电离辐射能够诱导小鼠外周血淋巴细胞中snord18b和snord18c上调,提示其可能与基因组不稳定性、免疫应答或是电离辐射响应具有潜在相关性;（2）SNORD18B和SNORD18C在结肠癌细胞系以及结肠癌组织中明显上调,可作为结肠癌的潜在诊断标志物;（3）高表达SNORD18B和/或SNORD18C的结肠癌患者预后较差,是结肠癌患者的独立预后因素,SNORD18B和SNORD18C可作为结肠癌患者的潜在预后标志物。第二部分SNORD18B/18C对结肠癌细胞增殖、侵袭迁移的调控作用目的:探讨SNORD18B和SNORD18C对结肠癌细胞增殖、侵袭迁移的调控作用。方法:首先通过CRISPR-Cas9和小RNA干扰技术构建SNORD18B和SNORD18C基因敲除或敲低细胞模型,采用慢病毒过表达技术构建SNORD18B和SNORD18C的过表达细胞模型,最后通过qPCR检测其敲低或过表达的效率。通过CCK-8实验和克隆形成实验,分析SNORD18B和SNORD18C表达水平对结肠癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。通过细胞划痕和Transwell实验,分析SNORD18B和SNORD18C表达水平对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响。通过裸鼠皮下荷瘤实验,在体内层面分析SNORD18B和SNORD18C表达水平对结肠癌细胞成瘤能力的影响。结果:（1）qPCR结果显示,SNORD18B和SNORD18C基因敲除/敲低及过表达细胞模型构建成功。CCK-8实验结果显示,敲低SNORD18B/18C后结肠癌细胞的增殖能力显著下降,完全敲除SNORD18B或SNORD18C同样抑制HCT116的增殖能力;而过表达SNORD18B或SNORD18C均可促进结肠癌细胞的增殖。克隆形成实验结果表明,敲低SNORD18B/18C后结肠癌细胞的克隆形成能力显著下降,完全敲除SNORD18B或SNORD18C也会抑制HCT116的克隆形成能力;而过表达SNORD18B或SNORD18C则可促进结肠癌细胞的克隆形成;（2）裸鼠皮下荷瘤实验的结果与上述结果一致,SNORD18B和SNORD18C敲除细胞株的成瘤能力明显弱于对照组,而SNORD18B和SNORD18C过表达株的成瘤能力则显著强于对照组;（3）细胞划痕和Transwell实验结果显示,敲低SNORD18B/18C可显著抑制HCT116细胞的侵袭与迁移能力,过表达SNORD18B或SNORD18C则可促进结肠癌细胞的侵袭与迁移。小结:（1）SNORD18B和SNORD18C可正向调控结肠癌细胞的增殖与克隆形成能力;（2）SNORD18B和SNORD18C可正向调控结肠癌细胞裸鼠移植瘤的生长;（3）SNORD18B和SNORD18C可正向调控结肠癌细胞的侵袭与迁移能力。第三部分SNORD18B/18C对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用目的:探讨SNORD18B和SNORD18C对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。方法:采用克隆形成实验联合单击多靶模型分析,观察敲除或过表达SNORD18B和SNORD18C基因对辐照后细胞克隆形成能力的影响,评估SNORD18B和SNORD18C表达水平对结肠癌细胞放射敏感性的影响。采用细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒,观察敲低或过表达SNORD18B和SNORD18C对细胞凋亡和周期的影响。通过给予辐照（10Gy）或400μM H2O2处理8小时,检测SNORD18B或SNORD18C稳定过表达细胞株的细胞凋亡情况,评估SNORD18B和SNORD18C表达水平对辐照或过氧化氢诱导细胞凋亡的影响。通过Western blot实验,检测敲低SNORD18B/18C对非同源末端连接修复（non-homologus end joining,NHEJ）通路主要蛋白、细胞周期相关蛋白以及DNA双链断裂标志分子γ-H2AX蛋白表达的影响。采用NHEJ-GFP荧光报告系统检测SNORD18B和SNORD18C敲除株的NHEJ修复效率。结果:（1）单击多靶模型分析结果显示,SNORD18B和SNORD18C敲除株的平均致死剂量、准阈剂量以及不同剂量下的存活分数均低于对照组,而SNORD18B和SNORD18C过表达稳定株的平均致死剂量、准阈剂量以及不同剂量下的存活分数均高于对照组,表明SNORD18B和SNORD18C对结肠癌细胞的放射敏感性具有显著的调控作用;（2）敲低SNORD18B/18C会诱导结肠癌细胞的凋亡,而过表达SNORD18B和SNORD18C则会抑制结肠癌细胞的凋亡。SNORD18B和SNORD18C过表达稳定株在辐照（10Gy）或400μM H2O2处理8小时后,其细胞凋亡水平明显低于对照组,提示过表达SNORD18B和SNORD18C可抑制电离辐射或H2O2诱导的细胞凋亡;（3）Western blot实验结果显示,敲低SNORD18B/18C会诱导结肠癌细胞内γ-H2AX蛋白水平的显著增加,并抑制NHEJ修复途径中DNA-PKcs、Lig4和Bcl-2蛋白的表达;NHEJ-GFP荧光报告系统结果表明,敲除SNORD18B和SNORD18C抑制结肠癌细胞的NHEJ修复效率。（4）敲低SNORD18B/18C后,结肠癌细胞的G0/G1期明显增加,S期细胞明显减少;而过表达SNORD18B和SNORD18C均能促进细胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期的转变,结肠癌细胞的S期和G2/M期均显著增加;细胞周期相关蛋白的检测结果表明,敲低SNORD18B和SNORD18C可引起细胞内DNA损伤且诱导DSBs的显著增加,DNA损伤可通过激活ATM、CHK2的磷酸化,抑制CDK2的磷酸化和Cycline E蛋白的表达（ATM/CHK2/CDK2/CyclineE轴）,从而激活细胞周期检查点,最终导致细胞周期阻滞在G0/G1期以进行DNA损伤修复。小结:（1）SNORD18B和SNORD18C可负向调控结肠癌细胞的放射敏感性;（2）SNORD18B和SNORD18C可通过负向调控结肠癌细胞凋亡减轻电离辐射诱导的细胞凋亡;（3）SNORD18B和SNORD18C参与调控NHEJ修复途径中主要蛋白的表达,通过调控NHEJ修复效率影响细胞的DNA损伤与修复;（4）SNORD18B和SNORD18C对结肠癌的细胞周期也具有调控作用,敲低SNORD18B和SNORD18C将引起结肠癌细胞的G0/G1期阻滞。第四部分SNORD18B/18C调控结肠癌细胞生长与放射敏感性分子机制的初步探讨目的:初步探讨SNORD18B/18C调控结肠癌细胞生长与放射敏感性的分子机制。方法:通过核质分离实验分析SNORD18B和SNORD18C的亚细胞定位。通过qPCR和Western blot实验,在mRNA和蛋白水平观察敲低SNORD18B/18C对其宿主基因RPL4表达的影响。采用转录组测序（RNA-seq）技术,筛选出敲低SNORD18B/18C后的差异表达基因,并通过进一步的生物信息学分析,筛选出潜在的下游信号通路;联合TCGA数据库中SNORD18B和SNORD18C差异表达mRNA的信号通路富集分析结果,筛选出最可靠的潜在下游信号通路,最后采用qPCR和Western blot验证关键通路蛋白的表达情况。结果:（1）核质分离的结果显示,SNORD18B和SNORD18C主要分布在细胞核内;（2）敲低SNORD18B/18C在mRNA和蛋白水平均未影响其宿主基因RPL4的表达。（3）转录组测序的差异基因功能分析显示,差异基因主要参与的生物过程有转录调控、多细胞生物发育、信号转导和离子运输等,差异基因主要所处的细胞内位置为细胞膜和细胞核等,差异基因主要的分子学功能有蛋白结合、金属离子结合、DNA结合以及DNA结合转录因子活性等。综合转录组测序和TCGA数据库的差异基因信号通路富集结果发现,PI3K-AKT通路在上述三种KEGG富集的结果中均排在前列;qPCR的验证结果表明,敲低SNORD18B/18C引起AKT3和CREB3L3 mRNA显著下降;Western blot的验证结果则显示,敲低SNORD18B/18C可抑制PI3K-AKT-CREB信号通路中PI3K、AKT、CREB总蛋白和磷酸化蛋白的表达,提示SNORD18B和SNORD18C可同时影响这些蛋白的表达与磷酸化形式,说明SNORD18B和SNORD18C可能是通过PI3K-AKT-CREB信号通路调控结肠癌细胞的生物学功能。小结:（1）SNORD18B和SNORD18C主要分布于细胞核内;（2）SNORD18B和SNORD18C对宿主基因RPL4的表达没有影响;（3）敲低SNORD18B和SNORD18C抑制PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、CREB和p-CREB蛋白的表达;（4）SNORD18B和SNORD18C可能是通过PI3K-AKT-CREB通路调控结肠癌细胞的生长和放射敏感性。结论1.SNORD18B和SNORD18C在结肠癌细胞系以及结肠癌组织中明显上调,可作为结肠癌诊断的候选标志物;2.高表达SNORD18B和/或SNORD18C的结肠癌患者具有较差的预后,是结肠癌患者的独立预后因素,能够作为结肠癌患者预后候选标志物;3.SNORD18B和SNORD18C可正向调控结肠癌细胞的生长、侵袭与迁移能力;4.SNORD18B和SNORD18C可负向调控结肠癌细胞的放射敏感性;5.SNORD18B和SNORD18C可能是通过PI3K-AKT-CREB通路调控结肠癌细胞的生长和放射敏感性。