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目的:本实验以胆脂瘤具有类似于肿瘤的侵袭性和肿瘤侵袭过程中的黏附、基质降解作为切入点,通过检测CD44V6和MMP-9在中耳胆脂瘤中的表达,以探讨两者在中耳胆脂瘤侵袭破坏中的作用及相关性。方法:1.免疫组化:收集2013年5月-2016年8月于西南医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科因中耳胆脂瘤或慢性化脓性中耳炎活动期行改良乳突根治术+鼓室成形术且病历资料完整的患者的中耳胆脂瘤石蜡块22例,中耳肉芽石蜡块11例,并将胆脂瘤组织按照有无听小骨破坏分为有听小骨破坏组和无听小骨破坏组两组。对照组为10例正常外耳道上皮新鲜标本,于2016年8月至2016年12月随机从慢性化脓性中耳炎活动期患者术中取得,所有标本均经病理证实;采用免疫组化方法和image pro plus软件,检测MMP-9、CD44V6在22例中耳胆脂瘤组织、11例中耳肉芽组织及10例正常外耳道深部皮肤中的表达,应用SPSS软件进行数据统计分析,比较三组表达差异、两分子与胆脂瘤骨质破坏的相关性并对两蛋白进行相关性分析。2.RT-PCR:收集2016年8月-2016年12月在西南医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院因中耳胆脂瘤或慢性化脓性中耳炎活动期行改良乳突根治术+鼓室成形术的患者术中标本20例,分为胆脂瘤组和肉芽组两组,其中胆脂瘤组有10例,并将胆脂瘤组织按照有无听小骨破坏分为有听小骨破坏组和无听小骨破坏组两组。肉芽组为10例,对照组为10例正常外耳道深部上皮。取得标本后直接浸入非冻型组织RNA保存液中,置于4℃冰箱过夜,第二天转移至-20℃冰箱保存,用于后续的RT-PCR实验。设计CD44V6、MMP-9的DNA上下游引物,采用RT-PCR方法检测CD44V6、MMP-9mRNA的表达,并对结果进行分组比较以及对基因进行相关性分析。结果:1.免疫组化结果:CD44V6阳性表达定位于细胞膜上,在中耳胆脂瘤上皮、肉芽以及外耳道上皮组织中均有不同程度的表达。在中耳胆脂瘤上皮染色最强,呈中-强度阳性表达,上皮组织各层细胞均有表达,其中以基底膜染色最强(平均光密度值0.2170±0.1023)。外耳道上皮呈弱阳性到中等强度阳性表达(平均光密度值0.1025±0.0204),而在肉芽组织呈弱阳性表达(平均光密度值0.0095±0.0083)。胆脂瘤组分别与外耳道皮肤组、肉芽组比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。胆脂瘤无听小骨破坏组,多呈中等强度染色(平均光密度值为0.1523±0.0343),而在胆脂瘤有听小骨破坏组中,多呈强阳性(平均光密度值为0.2811±0.0109),差异具有统计学意义(p<0.05)。MMP-9阳性表达定位于细胞浆上,呈棕黄色。在中耳胆脂瘤标本中,MMP-9蛋白未见表达于上皮,主要表达于上皮下结缔组织以及基质中如中性粒细胞、浆细胞在内的各种炎性细胞,表达主要呈弥散性分布,少数呈局灶分布;在肉芽组织中,MMP-9蛋白主要表达于新生毛细血管及周围呈弥散分布的炎性细胞。而在外耳道皮肤组织中,主要表达于上皮下浸润的少数炎性细胞,呈弱阳性表达。在中耳胆脂瘤组织中,阳性表达的平均光密度值为0.0250±0.0128;在肉芽组织中,阳性表达的平均光密度值为0.0127±0.0921;在正常外耳道皮肤组织中的平均光密度值是0.0046±0.0015,分别进行两两比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。在胆脂瘤无听小骨破坏组,阳性表达的平均光密度值为0.0130±0.0031,而在胆脂瘤有听小骨破坏组中,阳性表达的平均光密度值为0.0320±0.0107,差异具有统计学意义(p<0.05)。CD44V6和MMP-9表达的平均光密度值经pearson相关性分析,具有显著相关性(r=0.525,p=0.017<0.05)。2.RT-PCR结果:采用quantity one图像分析系统对扩增条带进行半定量分析,CD44V6mRNA在中耳胆脂瘤组织、正常外耳道皮肤及肉芽组织均有不同程度的表达,相对表达量分别为2.1907±0.7677、1.448±0.7402、1.0740±0.8790。分别与其他两组相比,CD44V6mRNA在中耳胆脂瘤组织标本中的相对表达量明显增加,差异均具有统计学意义(p<0.05)。MMP-9mRNA在8/11例中耳胆脂瘤组织和8/11例肉芽组织中有明显表达,相对表达量分别为0.6898±0.0815、0.5243±0.0752,而在11例正常外耳道皮肤中仅有7例有较弱的表达,相对表达量为0.1006±0.01365,与正常外耳道皮肤组相比,中耳胆脂瘤组织表达量明显增加,且差异具有统计学意义(p<0.05),然而与中耳肉芽组相比,差异不具有统计学意义(p>0.05)。随着骨质破坏的加重,CD44V6、MMP-9mRNA的相对表达量也相应增加。在无听小骨破坏组中,CD44V6mRNA的相对表达量为1.6109±0.1478;而在有听小骨破坏组中,CD44V6mRNA的相对表达量为2.7705±0.6809,两者之间比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。在无听小骨破坏组中,MMP-9 mRNA的相对表达量为0.1418±0.2076;而在有听小骨破坏组中,MMP-9 mRNA的相对表达量为1.2178±0.8646,两者之间比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。经pearson相关性分析,CD44V6mRNA和MMP-9mRNA的相对表达量具有显著相关性(r=0.493,p=0.006)。结论:1.MMP-9在中耳胆脂瘤和肉芽组织的新生毛细血管及周围炎性细胞中均表达增高,可能通过调节新生血管生成,增强胆脂瘤上皮的营养支持,并降解细胞外基质,促进胆脂瘤的侵袭破坏。2.CD44V6在胆脂瘤上皮中表达增高,通过上调炎症相关基因,促进胆脂瘤的发生、发展。3.胆脂瘤听小骨破坏组中CD44V6和MMP-9均表达增高,提示两者可能在胆脂瘤的侵袭破坏中发挥重要作用。4.在胆脂瘤组织中,CD44V6的表达增高,增强了MMP-9与胆脂瘤组织的锚定作用,进而促进细胞外基质降解;并可能通过作用于HA/CD44信号通路,上调MMP-9的表达,与MMP-9协同促进胆脂瘤的侵袭破坏。