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保幼激素(juvenile hormone,JH)是一种由昆虫咽侧体合成的倍半萜类激素,控制昆虫发育、变态和生殖。尽管JH核受体Methoprene-tolerant(Met)的鉴定和解析加快了JH分子作用机制的探索,然而对JH信号通路的作用机理还有待深入研究。飞蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要农业害虫,有很强的繁殖能力。JH调控飞蝗成虫羽化后第一个促性腺周期内的卵黄发生、卵巢发育以及卵成熟。因此,飞蝗是研究JH信号通路分子机制的理想模型。Krüppel homolog 1(Kr-h1)是JH的早期响应基因,在JH抑制幼虫或若虫变态及促进成虫生殖中发挥关键作用。Kr-h1转录受JH受体复合体(Met/Tai)激活,Kr-h1也直接调控靶标基因的转录。课题组前期研究发现,JH诱导Kr-h1的磷酸化,但触发其磷酸化的信号通路及其在基因转录调控中的作用有待阐明。本论文研究以飞蝗为实验模式,利用细胞生物学、分子生物学和遗传学等方法,探究Kr-h1的磷酸化修饰及其生物学功能。重点研究内容有三个:(1)确定Kr-h1磷酸化位点,鉴定触发Kr-h1磷酸化的蛋白激酶;(2)分析正常发育以及JH剥夺和诱导条件下Kr-h1磷酸化的动态变化,明确Kr-h1磷酸化修饰对JH的依赖,鉴定JH诱导Kr-h1磷酸化的信号转导途径;(3)解析Kr-h1磷酸化对靶基因转录的调控能力,阐明Kr-h1磷酸化在昆虫变态和生殖中的功能。通过构建突变载体,利用Western blot和IP实验筛选到Kr-h1可能的磷酸化位点Ser154。通过制备Ser154位点特异磷酸化抗体、λPP磷酸酶处理、RNA干扰、磷酸化Kr-h1量化分析等,确认Ser154是Kr-h1的磷酸化位点。分别在飞蝗若虫和成虫体内注射PLC抑制剂U73122、PKC抑制剂NPC、PKC-α双链RNA,再通过Western blot和免疫组化检测,明确了PKC-α是触发Kr-h1磷酸化的蛋白激酶。Western blot和免疫组化分析正常发育以及JH剥夺和诱导条件下Kr-h1磷酸化的动态变化的实验结果表明,Kr-h1磷酸化修饰依赖JH。双荧光素酶报告实验显示:在飞蝗若虫期,磷酸化的Kr-h1对成虫特异基因E93表达的抑制能力更强;而在飞蝗成虫期,磷酸化的Kr-h1对生殖相关基因RL36表达的激活能力更强。同时发现,磷酸化Kr-h1对E93转录的较强抑制能力在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和家蚕(Bombyx mori)的幼虫期保守存在。本论文的研究结果表明,JH通过蛋白激酶PKC-α诱导Kr-h1在Ser154位点发生磷酸化,进而提升对靶基因的转录调控能力,发挥维持若虫状态和促进成虫生殖的作用。这是首次阐述Kr-h1的磷酸化机制和功能,丰富了对JH非基因组信号通路的了解。