血管紧张素（angiotensin，Ang）是生物体内一类多肽类化合物家族，包括血管紧张素I（AngⅠ）,及其代谢产物血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)、血管紧张素Ⅲ（Ang Ⅲ)、血管紧张素Ⅳ（Ang Ⅳ)、血管紧张素1-9 （Ang 1-9)、血管紧张素1-7（Ang 1-7)、血管紧张素1-5（Ang 1-5)等 。 其 中Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiolensin-aldosterone system，RAAS）中的重要组分，能升高血压、影响组织重构，对心血管系统产生不利影响，血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）是产生AngⅡ的关键酶。基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是基质金属蛋白酶家族的重要成员，既往研究认为MMP-9对胚胎发育、组织修复、心血管重构、细胞通讯、肿瘤迁移等病理生理过程可产生重要影响。但MMP-9和高血压发生发展之间的关系尚不清楚。　　在我们前期的研究中，给大鼠输注MMP-9干预后，大鼠发生了高血压且循环血液中的Ang Ⅱ水平显著升高，但是其机制尚不清楚，推测其机制可能是MMP-9促进了ACE的表达或增强了ACE的活性，其二也可能灭活了分解AngⅡ的相关蛋白酶，还有一种可能是MMP-9本身即存在类似ACE分解AngⅠ产生AngⅡ的作用。研究MMP-9是否存在“类ACE”作用具有重要意义，将揭示MMP-9在RAAS调控中的重要作用，为预防和治疗相关心血管疾病提供新的靶点。　　因此本研究将围绕MMP-9是否存在“类ACE”作用展开设计，Ang Ⅱ在动脉血管内皮产生并发挥生理作用，人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）具有人动脉内皮细胞的生物学特性，是研究RAAS的重要平台，可以为血管紧张素的代谢提供微环境，因此我们选取 HUVEC 为研究平台，为了排除MMP-9可能存在的促ACE表达的作用，干扰研究结果，我们使用RNA干扰技术沉默ACE基因的表达，构建稳定沉默表达ACE蛋白的HUVEC模型。　　传统检测AngⅡ的方法是免疫法，但是我们研究设计是在细胞培养上清体系这个特殊且复杂得基质中添加外源性合成的Ang Ⅰ，应用免疫法需要制备相应抗体，而且难以避免复杂体系对检测的干扰，因此我们选择使用液相色谱质谱法，液相色谱质谱联用技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是生物蛋白组学和代谢组学研究中的前沿和核心技术，其在生物大分子的结构定性和定量分析当中有广泛的应用。既往有研究通过建立 LC-MS/MS的方法来检测血液和组织中的血管紧张素组分，但是缺乏LC-MS/MS对细胞培养上清中血管紧张素测定的完整方法，本研究需要针对HUVEC培养上清液建立一套基于液相色谱质谱联用技术对血管紧张素肽组分的靶向代谢组学分析方法，用于测定MMP-9干预后细胞上清液中AngⅡ水平的变化。同时建立基于LC-MS/MS技术对细胞培养上清液中血管紧张素肽组分的靶向代谢组学方法可为今后在细胞基础上用于完整描绘血管紧张素代谢网络和系统研究 RAAS 提供了强有力的分析策略，具有现实作用。　　本文主要的研究内容和研究结果如下：　　1.通过 RNA 干扰技术，构建携带干扰序列的重组质粒，包装以慢病毒为载体的细胞感染工具侵染原代HUVEC，建立了稳定沉默人脐静脉内皮细胞ACE基因表达的细胞模型，实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示两条干扰序列（ ACE-shRNA-1 和对ACE-shRNA-2）对模型细胞的ACE表达均产生了有效且稳定的干扰作用，ACE基因下调水平分别是99%和73%，ACE蛋白下调水平分别是98%和65%　　2.建立了针对人脐静脉内皮细胞培养上清样品中的血管紧张素代谢组分的二维纳升液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱平行反应监测模式的靶向定量分析方法。在方法建立过程中对细胞培养上清液样品的前处理方案进行优化，建立了以固相萃取技术为支撑的样品前处理方案。对流动相设置、进样体积等色谱条件以及离子源液流流速、离子源温度、毛细管电压、驻留时间等质谱参数进行了优化，建立依托高分辨质谱平行反应监测模式的靶向定量方法学。按照梯度稀释的方法将7种(AngⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,1-5,1-7,1-9)血管紧张素肽的标准品混合物加入到培养上清液的基质中，选取中浓度标准品混合液作为质控，考察方法学的线性关系、动态监测范围、灵敏度、精密度等指标。结果显示7种肽检测的线性相关系数达到0.99以上；检测范围跨越104数量级；灵敏度达10-15g级别。建立了针对细胞培养上清液样品中血管紧张素肽组分的最优检测方案。并应用于各ACE基因沉默组和对照组细胞培养上清中的血管紧张素肽组分含量差异的比较，结果显示AngⅡ的水平与ACE的表达正相关，与既往研究ACE在RAAS中的调控作用相吻合。辅证了本方法应用的可行性。　　3.完成以上研究工作后，选取 ACE 基因沉默效率最高的一组（ACE-shRNA-1）干扰细胞为模型，将180 ng/ml、900 ng/ml、1800 ng/ml的不同浓度的重组人MMP-9预先干预细胞24 h后与300 ng/ml的AngⅠ共孵育15 min，30 min，60 min，再以1800 ng/ml MMP-9组为干预对象，分别给予0.1μM、1μM、10μM的MMP-9专一抑制剂SB-3CT共同干预24 h后与300 ng/ml的AngⅠ共孵育60 min,观察AngⅡ含量的变化。CCK-8法检测细胞增值活力，Western Blot法检测细胞ACE蛋白表达水平。结果显示MMP-9上调了细胞培养上清液中AngⅡ的水平，其水平与MMP-9浓度和共孵育时间成正相关的时间-剂量依赖关系。Ang Ⅱ水平与SB-3CT浓度成负相关的剂量依赖关系，相比只添加MMP-9，降低了Ang Ⅱ的水平。组间细胞增殖活力和ACE蛋白表达水平无显著性差异。在体外无机缓冲盐系统中，将1800 ng/ml的重组人MMP-9、2 mM的4-乙酸氨基苯汞（一种胶原酶原激活剂）与3000 ng/ml的AngⅠ共孵育12 h后，产物中出现了AngⅡ。通过分子对接技术，以MMP-9为受体，Ang I为配体，研究MMP-9与Ang I发生酶化学反应的结构，发现MMP-9与Ang I通过分子间作用力形成紧密的受体配体关系。　　主要结论：　　1.本研究基于LC-MS/MS技术建立的靶向定量方法可以稳定且灵敏的检测人脐静脉内皮细胞培养上清液中多个血管紧张素肽组分。　　2.本研究结果显示MMP-9具有“类ACE”作用，可以分解AngⅠ产生AngⅡ。