论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是女性发病率最高的一种恶性肿瘤,迄今为止对乳腺癌发病的确切原因和发病机理尚不清楚。新资料发现,随着人们生活方式转变,乳腺癌发病率逐年上升且趋势呈现年轻化。虽然近年来乳腺癌的影像学检查、放疗、化疗、内分泌治疗和免疫治疗策略以及手术方式不断发展,但其生存率并无明显改善。所以,深入研究乳腺癌发病的分子机制,对乳腺癌早期诊断、治疗及临床预后都有着重要的意义。MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)是细胞内广泛表达的蛋白激酶,ZAK位于MAPK信号通路的上游,细胞中的过表达能激活MAPK信号通路。其信号传导途径的异常也可导致细胞生长失控和肿瘤发生。可见ZAK通过对MAPK等途径的调控,广泛影响了真核细胞的生命过程,具有重要的研究意义。在前期工作中我们利用TCGA和Oncomine公共数据库分析了ZAK在乳腺癌中的表达情况,初步发现ZAK在乳腺癌中存在着异常表达,提示ZAK可能与乳腺癌的发生发展有关,然而,ZAK在乳腺癌中的作用机制尚不明确,有待深入研究阐明。方法:从293T细胞中提取总RNA,逆转录出cDNA,根据ZAK的CDS序列设计含有Xho I和BamH I限制性内切酶位点的引物序列,PCR扩增目的基因,将双酶切得到目的片段连接到慢病毒表达质粒PLVX-IRES-Puro中,分别获得重组的稳定过表达ZAK载体和慢病毒干扰ZAK-shRNA载体;用293T细胞包装重组病毒颗粒并感染MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞,经puromycin筛选获得稳定转染细胞株。Realtime PCR和Western Blot分别检测ZAK mRNA水平及蛋白表达;随后利用实时无标记细胞分析仪(RTCA)检测过表达ZAK和干扰ZAK表达乳腺癌细胞株的增殖和迁移情况;并采用CCK-8增殖实验来进一步评估ZAK对乳腺癌细胞生长的相关性;最后用AnnexinV/PI试剂盒检测ZAK对细胞凋亡的影响,FlowJo软件分析结果,以探讨ZAK对乳腺癌细胞凋亡生物学行为的影响。结果:1.过表达ZAK的MDA-MB-231细胞株和MCF-7细胞株,其ZAK mRNA表达较对照组明显上调(P<0.01);干扰表达ZAK的两株乳腺癌细胞其ZAK mRNA表达较对照组都显著下调(P<0.05)。2.过表达ZAK的MDA-MB-231细胞株和MCF-7细胞株的增殖能力与对照组相比明显提高(P<0.01),迁移率显著增强(P<0.01);而干扰表达ZAK的两个乳腺癌细胞株的增殖能力与对照组相比都明显下降(P<0.01),其迁移率也明显减弱(P<0.01)。3.过表达ZAK的MDA-MB-231和MCF-7细胞株的凋亡率与对照组相比,显著降低(P<0.01);而干扰表达ZAK的两个乳腺癌细胞株的凋亡率与对照组相比,显著上升(P<0.01)。结论:1.ZAK促进乳腺癌细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡;2.ZAK基因沉默后可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡;