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食管癌是我国常见的上消化道恶性肿瘤。对于局部晚期食管癌患者来说,同步放化疗是标准治疗手段。获得性放疗抵抗的发生,是食管癌局部复发和远处转移的主要原因之一。目前研究表明,肿瘤放疗抵抗的形成可能由于微环境缺氧、DNA损伤修复、癌基因或抑癌基因的突变或信号通路的改变所致。但食管癌放疗抵抗形成的具体机制,目前仍未明确。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌症研究的热点之一,它与肿瘤细胞的侵袭和转移,化疗耐药和肿瘤干细胞的关系密切。同时EMT在肿瘤放疗抵抗过程中起着重要的作用,发生EMT的肿瘤细胞可获得抗凋亡能力,从而导致肿瘤放疗耐受。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长发育和分化的关键通路之一。当Wnt/β-catenin信号通路异常激活时,β-catenin在细胞质中聚集、易位到细胞核内,与TCF/LEF家族转录因子结合,开启了下游靶基因的转录。该通路任何成分的突变和异常表达都可能导致机体生长发育的缺陷及肿瘤的发生。研究证实Wnt/β-catenin信号通路调控食管癌的发生和发展。研究发现多种类型的肿瘤经多次分割照射后Wnt/β-catenin信号通路异常激活,可能与放疗抵抗密切相关,。用sFRP3抑制Wnt/β-catenin通路,Slug和Twist等EMT诱导因子表达下调,逆转肿瘤细胞EMT表型。microRNA(miRNA)是一个内源性非编码RNA家族,长度为18-25个核苷酸,通过与靶基因3’UTR区(非翻译区)配对结合,促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译。miRNA参与调节细胞增殖、分化、代谢和凋亡等过程,并在肿瘤发生和发展过程中起重要作用。miRNA的特异性表达模式与临床肿瘤治疗的预后密切相关。miRNA通过调节信号通路直接影响放射敏感性,包括DNA双链断裂修复、细胞周期检查点激活、细胞凋亡和自噬。microRNA-1275(miR-1275)位于第6号染色体上,在肝细胞癌及口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤起着重要作用。但是,miR-1275在食管癌放疗抵抗形成的作用及调控机制尚不清楚。研究目的:(1)筛选食管癌细胞放疗抵抗相关的microRNA;(2)探索miR-1275对食管癌细胞放疗抵抗及EMT表型的影响;(3)揭示miR-1275调控食管癌细胞放疗抵抗形成的分子机制。研究方法:第一部分:放疗抵抗食管癌细胞microRNA表达谱的研究。采用梯度剂量法照射食管癌细胞株KYSE-150,筛选出具有放疗抵抗的细胞株KYSE-150R,检测其克隆形成能力;Western blot检测两组食管癌细胞的EMT相关蛋白。采用miRNA芯片检测放疗抵抗食管癌细胞株KYSE-150R和亲本KYSE-150 miRNA表达的差异。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表达谱结果中一些候选miRNA的相对表达,并对潜在的miRNA靶点进行生物信息学分析。将下调miRNA mimic转染至KYSE-150R细胞,检测细胞的增殖抑制率。第二部分:研究miR-1275对食管癌细胞放疗敏感性及EMT表型的影响。分别向KYSE-150R和KYSE-150转染miR-1275 mimic和inhibitor,通过克隆形成实验检测miR-1275对细胞放射敏感性的影响,MTT实验检测miR-1275对细胞增殖能力的影响,Transwell实验和划痕实验检测miR-1275对细胞迁移能力的影响,Western blot检测miR-1275对细胞的EMT表型的调控。构建皮下移植瘤模型,检测miR-1275在体内是否对食管癌放疗抵抗发挥调控作用。第三部分:miR-1275靶向基因WNT1对食管癌细胞放疗抵抗形成的机制研究。本研究利用生物信息学分析筛选miR-1275的可能靶基因。用PCR、双荧光素酶报告基因实验验证miR-1275与其靶基因WNT1之间的调控关系。因WNT1是WNT/β-catenin信号转导通路的重要调控分子,向食管癌细胞KYSE-150R和KYSE-150分别转染miR-1275 mimic和 inhibitor,采用 Western blot 检测 WNT/β-catenin 信号转导通路中 WNT1、c-myc 和 Slug、GSK-3β、p-GSK-3 β,β-catenin及p-β-catenin蛋白表达水平的影响;TOP/FOP荧光素酶活性测定Wnt/β-catenin信号通路的活性,来研究miR-1275对WNT/β-catenin信号的调控作用。干扰WNT1表达,检测其对食管癌细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响。功能回复实验验证干扰WNT1表达能否逆转miR-1275对食管癌细胞放射敏感性及EMT表型的影响,选取KYSE-150R细胞分别转染 NC-mimic、miR-1275 mimic 或 miR-1275 mimic+pcDNA3.1/WNTl,选取 KYSE-150 细胞分别转染 NC-inhibitor、miR-1275 inhibitor 或 miR-1275inhibitor+si-WNTl,通过克隆形成实验检测每组细胞的放射敏感性;MTT实验检测每组细胞的增殖能力;Transwell实验和划痕实验检测每组细胞的迁移能力;Western blot检测每组细胞的EMT相关蛋白。研究结果:第一部分:通过梯度剂量法照射成功建立了放疗抵抗性细胞株KYSE-150R细胞,证实其获得EMT的表型。miRNA芯片结果显示10个miRNA表达显著上调,25个miRNA表达显著下调。qRT-PCR证实了 miR-1275、miR-301a和miR-18b表达下调与芯片结果相一致。miR-1275mimic能够显著上调KYSE-150R细胞对放疗的敏感性,提示其可能起放疗增敏作用。第二部分:克隆形成实验显示过表达miR-1275导致KYSE-150R细胞放射存活率降低;转染miR-1275 inhibitor后KYSE-150细胞放射存活率增高。MTT实验显示上调miR-1275抑制KYSE-150R细胞增殖,而下调miR-1275促进KYSE-150细胞增殖。Transwell迁移实验显示,miR-1275过表达减少了 KYSE-150R细胞的迁移数量;而miR-1275低表达明显增加了 KYSE-150细胞的迁移数量。同时,划痕试验证实过表达miR-1275对食管癌细胞迁移的抑制作用。KYSE-150R细胞转染miR-1275 mimic后,E-cadherin表达上调、N-cadherin和Vimentin下调,提示EMT表型减弱;而抑制miR-1275促进KYSE-150细胞的EMT表型。KYSE-150R细胞转染miR-1275 mimic形成的裸鼠皮下移植瘤,肿瘤的大小和生长速度,均低于KYSE-150R对照组。过表达miR-1275致体内KYSE-150R细胞的E-cadherin表达下调,N-cadherin和Vimentin表达上调。第三部分:qRT-PCR结果显示miR-1275下调WNT1 mRNA基因表达。双荧光素酶报告基因证明miR-1275直接调控靶基因WNT1的3’ UTR区。与KYSE-150细胞相比,KYSE-150R细胞中β-catenin及其靶点c-myc和Slug的蛋白表达水平上调,提示Wnt/β-catenin信号通路异常激活。KYSE-150R 细胞转染 miR-1275 mimic 后,WNT1、P-GSK-3β 和β-catenin 蛋白水平下调,GSK-3β、P-β-catenin蛋白水平上调,提示miR-1275的上调显著抑制了 Wnt/β-catenin信号通路,并且miR-1275表达水平的高低与TOP/FOP 比值成反比,说明miR-1275调控食管癌细胞的Wnt/β-catenin 信号通路。在 si-WNT1或 pcdna3.1/WNTl 转染后,miR-1275 inhibitor 组或 miR-1275 mimic组的Wnt/β-catenin信号通路的活性分别被部分逆转。功能回复实验发现,KYSE-150细胞转染miR-1275 inhibitor后,细胞增殖及迁移能力明显增强、放射敏感性减弱,共转染miR-1275 inhibitor及si-WNT1后,细胞回复为细胞增殖及迁移能力增强、放射敏感性减弱表型,但仍不及miR-1275 inhibitor单转染组;KYSE-150R细胞转染miR-1275 mimic后,细胞增殖及迁移能力明显减弱;放射敏感性增强,共转染miR-1275 mimic及pcDNA3.1/WNT1后,细胞回复为增殖及迁移能力减弱、放射敏感性增强表型,但仍不及miR-1275 mimic单转染组。共转染miR-1275 inhibitor及si-WNT1后,细胞回复为EMT加强型,但仍明显不及miR-1275 inhibitor单转染组;共转染miR-1275 mimic及pcDNA3.1/WNTl后,细胞回复为细胞EMT减弱表型,但仍不及miR-1275 mimic单转染组。研究结论:(1)研究发现了放疗抵抗食管癌细胞中一组独特的miRNA表达谱,其中miR-1275低表达与食管癌的放疗抵抗可能密切相关。(2)过表达miR-1275可提高食管癌细胞的放射敏感性、抑制增殖及迁移能力及逆转EMT表型。(3)WNT1是miR-1275的靶基因。miR-1275通过靶向WNT1调控Wnt/β-catenin信号通路,对食管癌细胞的放射敏感性、增殖、迁移及EMT表型进行调控,为寻找克服食管癌放疗抵抗的靶点提供了依据。