论文部分内容阅读
目的临床发现,在阳光较强烈的夏季和秋季一部分白癜风(Vitiligo)患者会出现发病频繁和病情加剧的情况,紫外线(Ultravioletrays,UV)灼伤皮肤,可发生脱色斑等情况,紫外线B(Ultraviolet rays B,UVB)照射可能会诱导黑色素细胞(Melanocytes,MC)发生衰老,这是由于黑色素细胞作为功能细胞,大量合成黑色素时,超负荷的工作会导致其过早衰老,黑色素合成能力降低或丧失,从而引发或加重白癜风的发生或发展。强烈的UV照射可能是诱发或加重白瘢风的因素之一;同时有研究发现紫外线可使MC内酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)活性增强,黑色素增多。综上所述,紫外线对黑色素合成的影响具有双重性,存在剂量阈值,既可以促进黑色素的产生,又可以通过损伤黑色素细胞抑制黑色素合成。因此,阐明UVB作用于黑色素合成细胞-黑色素细胞和角质形成细胞(Keratinocytes,KC)的机制有重要意义。方法1.原代黑色素细胞培养:取成年男性包皮样本,使用70%乙醇浸泡消毒,用PBS溶液洗掉乙醇;剪掉脂肪和皮下组织,将皮肤切成5 mm宽的长条;加0.25%胰蛋白酶溶液,于4℃冰箱中孵育18 h;用刀片分离真皮和表皮,弃去真皮,将表皮转移到含有PBS液的离心管中,于室温下摇床旋转摇动孵育;室温下,将细胞悬液洗涤离心,用M254培养基培养,在37℃,5%CO2条件下培养48-72 h;离心更换培养液,一周进行两次培养传代。2.紫外线照射:采用SH4B-T紫外光疗仪,按照实验分组中各组所需的UVB剂量照射原代黑色素细胞和Hacat细胞,照射完成后于37℃,5%CO2的恒温细胞培养箱中继续培养至24、48和72 h。3.NaOH法测定黑色素含量、生化酶法测黑色素合成限速酶酪氨酸酶活性、Western Blot检测黑色素细胞刺激素(Melanocyte stimulating hormone,MSH)蛋白表达变化。4.细胞早衰表征检测:姬姆萨染色观察细胞形态,MTT实验和克隆形成实验检测细胞增殖变化,使用衰老相关 β-半乳糖苷酶(Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色实验观察细胞染色早衰阳性率,利用Lyso-Tracker荧光探针实验检测细胞溶酶体变化,利用划痕实验检测细胞迁移能力的改变,蛋白免疫印迹检测早衰相关分子表达。5.利用Western Blot检测不同剂量UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞后72 h,P62、GATA4蛋白表达变化,继而利用ATM抑制剂Ku55933、ATR抑制剂VE-821和P53抑制剂Nutlin-3处理原代黑色素细胞和Hacat细胞后,检测细胞中GATA4蛋白表达变化。6.统计方法:采用SPSS 23统计软件进行实验数据分析,数据符合正态分布,两组之间比较采用独立样本,单因素方差分析,以α=0.05为检验水准,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.20、50、80、100、150和200 mJ/cm2 UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞后72 h,当照射剂量小于80 mJ/cm2时,随着照射剂量的增加原代黑色素细胞和Hacat细胞黑色素含量逐渐增多,在80 mJ/cm2时达到峰值,在100、150和200 mJ/cm2时原代黑色素细胞和Hacat细胞黑色素含量降低,不同剂量间差异有统计学意义(P<0.05)。2.与0 mJ/cm2相比,20、50、80和100 mJ/cm2 UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞后72 h,原代黑色素细胞和Hacat细胞酪氨酸酶活性增强(P<0.05),MSH蛋白表达量随照射剂量的增加而增多(P<0.05),差异有统计学意义。3.用20、50、80和100 mJ/cm2 UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞,原代黑色素细胞和Hacat细胞形态发生改变,克隆形成率和存活分数降低,β-半乳糖苷酶染色实验早衰阳性率增高,Lyso-Tracker荧光探针溶酶体荧光增强,数量增多,迁移能力降低,早衰相关分子表达激活,不同剂量间差异均有统计学意义(P<0.05),UVB诱导原代黑色素细胞和Hacat细胞早衰。4.经20、50、80和100 mJ/cm2 UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞后72 h,原代黑色素细胞和Hacat细胞P62表达受到抑制、GATA4表达增高;加入ATM抑制剂Ku55933和ATR抑制剂VE-821处理后,GATA4表达未有明显增加,经Nutlin-3处理的照射组,GATA4表达增加。结论UVB照射影响原代黑色素细胞和Hacat细胞黑色素表达水平,进一步研究发现UVB通过激活酪氨酸酶活性和引起MSH蛋白高表达进而增加黑色素合成;同时研究发现UVB照射原代黑色素细胞和Hacat细胞后伴随有细胞早衰的发生,P53、P16、P62早衰通路被激活;针对尚未阐明的辐射诱导P62信号通路深入研究发现,UVB通过P62介导的选择性自噬激活P62-GATA4早衰通路,诱导黑色素细胞和角质形成细胞发生早衰进而抑制黑色素的合成,推测是过量紫外线照射使白癜风患者发病或病情加重的机制之一。