论文部分内容阅读
茶是21世纪的健康饮料,体内富含茶多酚、咖啡碱、氨基酸等生理活性成分。儿茶素是茶多酚的主要组成物质,对茶叶品质的好坏和保健功效起重要作用。茶叶中的儿茶素分为表型儿茶素和非表型儿茶素,普通茶叶中儿茶素含量以表型儿茶素尤其EGC G为主,而珍稀茶叶资源南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla chang)却以非表型儿茶素尤以GCG和C为主,表现非常特殊的儿茶素代谢特性。为阐明南昆山毛叶茶特殊儿茶素代谢的机理,本研究以南昆山毛叶茶为主要研究材料,以高表型儿茶素含量的英红九号茶叶为对照材料,高通量测序比较了两研究材料的基因表达转录谱,通过cDNA文库筛选和RT-PCR技术克隆了两茶叶中儿茶素合成关键酶基因无花色素还原酶基因(LAR)和花青素还原酶基因(ANR),在序列比较的基础上,利用定量PCR比较了克隆基因在茶体内的表达水平,经重组DNA技术构建了克隆基因的原核表达系统,并确定了对应于基因的特异多肽用于后续抗体制备以深入研究茶体内靶基因的蛋白表达,获得结果主要如下:(1)儿茶素含量分析采用HPLC测定茶叶体内的儿茶素含量表明,南昆山毛叶茶以非表型儿茶素为主,含量最高的是GCG,含量高达5.24%,其次是含量为1.8%的C,而英红九号以表型儿茶素为主,含量最高的是EGCG,含量达1.68%。(2)转录组测序及数据分析通过对研究材料中基因转录水平的表达谱高通量测序及数据分析,从南昆山毛叶茶和英红九号茶叶中得到的Unigene分别为79,958条和Unigene87,359条。较之英红九号,南昆山毛叶茶中表达上调和下调的Unigene分别达到23378个和22510个。功能注释结合基因差异表达分析表明,参与茶叶儿茶素合成代谢的差异表达基因有513个,其中调控儿茶素合成的关键酶基因LAR和ANR,对应的Unigene在南昆山毛叶茶和英红九号中具有不同的表达模式,但均表现为在南昆山毛叶茶中的表达水平低于英红九号。(3)LAR基因和ANR基因的克隆利用cDNA文库筛选技术和RT-PCR技术,在南昆山毛叶茶(MY)和英红九号(YH)中均克隆了LAR及ANR基因,分别命名为YH-LAR(全长为1182bp)、MY-LAR(全长1112 bp)、YH-ANR(全长为1339bp)、MY-ANR(1014bp)。克隆的LAR及ANR基因在两研究材料中对应编码区均完全一致,其中LAR编码区包含核苷酸1029bp,编码氨基酸342个;ANR编码区核苷酸长1014bp,编码337个氨基酸。YH-LAR和MY-LAR基因与国际数据库茶叶中已登陆的LAR基因具有95%以上的同源性,YH-ANR及MY-ANR基因与国际数据库茶叶中已登陆的CsANR2类基因具有97%以上的同源性,属CsANR2类基因。(4)LAR和ANR基因的定量PCR分析q RT-PCR分析表明,LAR及ANR基因在英红九号茶叶中的表达量均比南昆山毛叶茶中的高,其中LAR基因在英红九号中的相对表达量为南昆山毛叶茶中的16.7倍,ANR基因在英红九号中的相对表达量为南昆山毛叶茶中的3.6倍。(5)LAR和ANR基因的原核表达及多克隆抗体的制备通过重组DNA技术将LAR和ANR基因分别构建进原核表达载体pET-32a(+),成功构建出两基因原核表达载体pET-32a-LAR和p ET-32a-ANR;通过分析LAR及ANR基因预测编码蛋白的二级结构、抗原性、亲疏水性、表面触等,确定了LAR及ANR基因特定多肽序列用于后续特异抗体的制备。