目的:通过微生物遗传学、生物化学与分子生物学等分析手段系统的研究，较为全面的阐述Escherichia coli IscA及其同源蛋白SufA在铁硫簇组装中的生理功能，以及铜离子结合IscA蛋白质介导的铁硫簇组装障碍而杀菌的具体机制，从而为铁硫簇组装机制和铜的杀菌机制研究奠定了重要的理论基础。　　方法:　　1.Escherichia coli IscA/SufA蛋白在不同类型铁硫簇合成中的功能研究　　2.铜离子结合E.coli IscA蛋白介导的杀菌机制研究　　结果:　　1.E.coli IscA/SufA蛋白在不同类型铁硫簇合成中的功能研究　　1.1.添加支链氨基酸和硫胺素能部分恢复E.coli iscA/sufA双突变菌在M9基础培养基中的生长在有氧生长条件下，E.coli iscA/sufA双突变菌在M9基础培养基中产生不能生长的表型，在M9基础培养基中添加1.0μg/mL的硫胺素不能恢复E.coli iscA/sufA双突变菌的生长，但添加90μg/mL的三种支链氨基酸能少量恢复E.coli iscA/sufA双突变菌的生长，同时添加硫胺素和支链氨基酸入M9基础培养基中，能够进一步增加E.coli iscA/sufA双突变菌的生长。　　1.2.有氧生长条件下，iscA/sufA双突变菌内IlvD蛋白不能组装[4Fe-4S]铁硫簇在有氧条件下，支链氨基酸合成途径中IlvD，表达于fscA/sufA双突变菌中与表达于野生型、iscA和sufA单突变菌相比，几乎没有活性，而蛋白表达量没有明显影响。纯化于野生型E.coli中的IlvD蛋白在415 nm具有一个典型的[4Fe-4S]铁硫簇且有完全的活性，而纯化于E.coli iscA/sufA双突变菌中的IlvD蛋白消失了415nm处吸收峰且没有活性，IlvD蛋白铁和硫含量测定显示纯化于野生型E.coli中的每摩尔IlvD蛋白含有1.6±0.4摩尔铁和1.4±0.3摩尔无机硫，表明大约40％纯化的IlvD蛋白含有完整的[4Fe-4S]铁硫簇。相反，纯化于E.coli iscA/sufA双突变菌中的IlvD蛋白测不到铁和硫的含量。　　1.3.IscA-Fe/SufA-Fe能提供铁给二羟酸脱水酶IlvD进行[4Fe-4S]铁硫簇的体外组装 IscA-Fe与apo-IlvD、半胱氨酸脱硫酶IscS、L-半胱氨酸(L-cysteine)和二硫苏糖醇在37℃有氧条件下孵育，IlvD活性很快得到恢复，而对照样品apo-IscA，在孵育后IlvD活性没有恢复。IlvD经离子交换层析柱MonoQ再次纯化后蛋白在415 nm处出现特异的IlvD铁硫簇吸收峰，表明IlvD经过体外重组后[4Fe-4S]铁硫簇已经组装到蛋白质上;利用SufA-Fe作为铁的供体，我们获得了类似的结果。　　1.4.IscA/SufA蛋白参与了其它铁硫酶中[4Fe-4S]铁硫簇组装在野生型E.coli和iscA/sufA双突变菌中重组表达硫胺素生物合成途径中的ThiC、三羧酸循环中途径中的aconitase B和DNA碱基切除修复途径中核酸内切酶Ⅲ，SDS-PAGE电泳分析结果显示IscA/SufA的缺失没有明显的影响蛋白质的表达和接下来的纯化，蛋白质全波长扫描结果显示纯化于野生型E.coli中的ThiC、aconitaseB和核酸内切酶Ⅲ分别在410、413和419nm处出现[4Fe-4S]结合的吸收峰，并且蛋白质都测到一定浓度的铁和硫，而纯化于iscA/sufA双突变菌中的ThiC、aconitaseB和核酸内切酶Ⅲ没有出现相应铁硫簇的吸收峰也测不到铁和硫的含量。　　2.铜离子结合E.coli IscA蛋白介导的杀菌机制研究　　2.1.在ISC铁硫簇组装系统中IscA蛋白具有独特的且很强的铜离子结合能力在LB培养基中添加200μM CuSO4对表达于copA/cueO/cusA三突变菌中IscS、IscU、HscB、HscA和Ferredoxin的全波长扫描光谱几乎没有影响，唯独IscA蛋白在258 nm处出现了1个蛋白质半胱氨酸残基与Cu(Ⅰ)结合的特异吸收峰，蛋白中铜元素含量结果显示每分子IscA蛋白二聚体含有0.60±0.09分子铜原子，而在IscS，HscB和HscA蛋白中只有非常微量或未检测到铜元素，IscU和ferredoxin蛋白保留有少量，并且可重复实验数量的铜元素，但蛋白中铜元素在后续纯化步骤中会进一步减少，说明铜离子与IscU和ferredoxin蛋白的结合力较弱;在添加200μM CuSO4 LB培养基中生长的copA/cueO/cusA三突变菌中表达并纯化获得的IscA蛋白，无EPR信号，而当使用2.5％(v/v)硝酸处理纯化后的IscA蛋白，使其结合的Cu(Ⅰ)被氧化，出现了一个典型的以Cu(Ⅱ)为中心的EPR信号，定量Cu(Ⅱ)的EPR信号表明纯化后的IscA蛋白含有0.55±0.12铜原子/IscA二聚体，与采用新亚铜试剂测定的结果基本一致;在LB培养基中诱导copA/cueO/cusA三突变菌中重组IscA蛋白的表达，并且与不同浓度的铜离子孵育，结果表明，当CuSO4浓度从0增加至1 mM时，与IscA蛋白结合的铜离子逐步从0增加到大约1.4铜原子/IscA二聚体，然而copA/cueO/cusA三突变菌的生长量却降低了30％，细菌的生长与IscA铜结合相关性分析结果显示当铜离子浓度从0增加到1mM时，铜离子与IscA蛋白的结合量与copA/cueO/cusA三突变菌的生长量呈负相关关系。　　2.2.IscA蛋白体外铜离子结合活性 apo-IscA与CuSO4共孵育并将IscA蛋白重新纯化，随着溶液中铜离子浓度的不断增加，纯化获得的IscA蛋白在258 nm处的吸收峰峰值和铜元素含量逐渐增加，并且当CuSO4浓度为IscA蛋白两倍以上时，IscA结合的铜离子含量达到饱和值（2.2±0.4铜原子/IscA二聚体），IscA结合的铜离子含量与低浓度铜离子时几乎是线性关系，再纯化的IscA蛋白，采用2.5％（v/v）硝酸处理就会出现了典型的Cu(Ⅱ)结合为中心的EPR信号，随着溶液中CuSO4浓度的不断增加，EPR信号强度也逐渐增加;离子交换层析法分析重新纯化后获得的IscA蛋白，铜离子结合IscA蛋白后导致蛋白洗脱峰从第10和11管(apo-IscA)迁移至第13和14管（结合铜离子的IscA蛋白），表明IscA结合铜离子后其蛋白构象可能发生显著变化。　　2.3.IscA中保守的半胱氨酸残基参与了铜离子的结合当将野生型apo-IscA与铁/铜离子孵育分别生成铁结合形式IscA（在315nm处有一吸收峰）或者铜结合形式IscA（在258 nm处有一吸收峰），与此相反，当将突变型IscA与铁或铜离子孵育后未检测到对应的吸收峰，蛋白质中铁和铜含量的测定结果显示，突变体IscA与铁/铜孵育并再纯化后没有测到铁/铜含量，与光谱学分析的结果一致;在添加有铁/铜离子的LB培养基中，在E.coli copA/cueO/cusA三突变菌中表达野生型IscA及其突变体蛋白，同样，不像野生型IscA蛋白，IscA突变体蛋白没有结合任何铁或铜离子。这些表明IscA蛋白中三个保守半胱氨酸残基是维持其铁和铜离子结合活性必需位点。　　结论:根据实验结果可以得出以下结论:(1)IscA/SufA蛋白主要参与了有氧生长条件下E.coli中[4Fe-4S]铁硫簇的组装，而不参与[2Fe-2S]铁硫簇的组装，所以[4Fe-4S]铁硫簇和[2Fe-2S]铁硫簇可能具有完全不一样的合成途径;(2)IscA蛋白除了铁结合能力外，还具有独特的且很强的铜结合能力，IscA中三个保守的半胱氨酸残基对蛋白质结合铜和铁都很重要;(3)过量铜还能够通过竞争结合IscA中铁的结合位点，从而影响E.coli中[4Fe-4S]铁硫簇的组装，而对[2Fe-2S]铁硫簇的组装没有明显影响;(4)IscA的缺失或者培养基中加铜都能导致[4Fe-4S]铁硫簇的组装障碍，而在IscA缺失情况下加铜不能进一步加重[4Fe-4S]铁硫簇的组装缺陷，说明IscA可能是铜的主要毒性靶点;(5)铜对于铁硫蛋白预先组装好的[4Fe-4S]铁硫簇没有明显的影响，而对于新合成的蛋白中[4Fe-4S]铁硫簇组装影响显著，说明铜主要是影响了铁硫簇的合成过程。所以铜能特异结合IscA蛋白，从而来抑制IscA介导的[4Fe-4S]铁硫簇的生物合成。