研究背景及目的:慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是全球公共的健康问题,血管钙化(Vascular calcification,VC)是慢性肾脏病并发心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的主要病理基础,是慢性肾脏病致死的高危因素。慢性肾脏病所引起的钙磷代谢紊乱,尿毒症,微炎症等内环境会致使多种机制参与血管钙化的发生发展,包括血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMCs)成骨样改变、自噬、凋亡等,并且受到多种信号通路和因子的调控,但CKD血管钙化的发病机制复杂,目前尚未完全阐明。现代医学对于CKD血管钙化的治疗多集中在对其危险因素的控制,尚无行之有效的办法,并且作用靶点单一,所以治疗慢性肾脏病血管钙化是目前研究的难点和热点。导师根据中医学对慢性肾脏病血管钙化病因病机的认识,并且结合多年临证经验拟补肾活血方,提出“补肾活血,化瘀祛浊”的治疗方法。大量的临床及前期研究也显示,补肾活血方可以保护肾功能,改善慢性肾衰肾性骨病患者总体生存质量及钙磷代谢,并且初步探索证实补肾活血方可以通过抑制主动脉平滑肌细胞的成骨样改变来抑制主动脉血管钙化。但是补肾活血方对慢性肾脏病血管钙化的具体调控机制并未完全阐明,本研究基于本课题前期研究结果,在体内和体外以细胞凋亡和自噬两个途径为切入点,对该方防治慢性肾脏病血管钙化的机制进行深入的挖掘和研究。研究方法:1.将90只大鼠按体量随机均分为正常组,模型组、骨化三醇组,中药高剂量组,中药中剂量组,中药低剂量组,每组15只。除正常组大鼠外,其余组大鼠第1-4周均给予250mg/kg剂量腺嘌呤混悬液灌胃及含1.2%高磷饲料喂养,第5-8周腺嘌呤改为125mg/kg隔日灌胃,继续给予1.2%高磷饲料喂养。同时中药组用补肾活血方灌胃治疗,大鼠中药给药剂量依据人-大鼠体表面积换算(1:6.25),并按临床成人用药量的4倍、2倍、1倍剂量给药,分为中药高(5.6g/kg·day)、中(2.8g/kg·day)、低(1.4g/kg·day)剂量组。正常组灌胃等量0.9%氯化钠溶液,连续给药8周。给药结束后,观察大鼠的一般表现,检测大鼠体重。肉眼观察各组大鼠肾脏变化,HE染色、Masson染色观察肾组织病理改变。茜素红染色观察主动脉钙化结节情况。透射电镜观察自噬小体及钙化结节等血管超微结构变化。腹主动脉取血检测血清钙(Ca)、磷(Pi)、血肌酐(CREA)、尿素氮(UREA)。免疫印迹法(Western-Blot)检测主动脉 α-SMA、ALP、Bcl-2、Bax、Caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ Becline1、Akt、mTOR蛋白的表达及磷酸化水平。2.采用体外培养和传代的方法,以不同浓度的磷(Pi 1.4mmol/L,Pi 2.0mmol/L、Pi 2.6mmol/L、Pi 3.2mmol/L)干预血管平滑肌细胞,建立血管平滑肌细胞钙化模型,模拟血管钙化的微环境。在不同时间点(3d,6d,9d,12d)分别以茜素红染色、钙含量检测,并用MTT法检测细胞活力,观察不同浓度磷对血管平滑肌细胞钙化的影响。在Pi 2.6mmol/L的钙化模型条件下,于第9天,通过流式细胞仪分析细胞凋亡率的方法观察凋亡和血管平滑肌细胞钙化的关系,并且在不同的时间点观察血管平滑肌细胞ROS含量的变化情况。同时以不同浓度的凋亡抑制剂(1uM,2.5uM,5uM,10uM)干预,在第9天通过茜素红染色和细胞钙沉积的检测观察凋亡和血管平滑肌细胞钙化之间的联系。3.将60只SD雄性大鼠称重后随机分为2组,空白组15只给予生理盐水灌胃,余组大鼠按照3g/100g给予补肾活血方灌胃,早晚各一次,连续灌胃5次,末次灌胃前禁食12h,于末次灌胃后1h,麻醉,腹主动脉采血,离心,灭活处理制备含药血清并-80℃保存备用。采用体外培养和传代的方法,以含Pi2.6mmol/L培养基构建血管平滑肌细胞钙化模型,同时分别给予不同梯度的补肾活血方含药血清(5%,10%,20%)干预,在不同的时间点,分别采用茜素红染色,钙含量测定鉴定血管平滑肌细胞钙化的程度;在第9天利用DAPI染色观察蓝色荧光区域的变化,流式细胞仪分析补肾含药血清对细胞凋亡的影响;第6天通过检测正常组,模型组和含药血清中剂量组观察ROS含量的变化情况。Western-Blot法检测血管平滑肌细胞 α-SMA、ALP、Bcl-2、Bax、Caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ,Becline 1、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达。研究结果:1.动物表现:与正常组大鼠比较,模型组大鼠体量明显下降,毛散乱竖起,体重增长缓慢、多饮、多尿、体毛干枯脱落、畏寒拱背。骨化三醇组大鼠状态类同模型组。中药各剂量组相比模型组大鼠毛发色泽及精神状态较好,尤其以中药中剂量、高剂量比较明显。肾脏外观和病理表现:正常组肾脏外观大小、颜色正常,模型组肾脏体积明显增大,表面凹凸不平,颜色苍白形成明显的“大白肾”;骨化三醇组肾脏相对模型组体积无明显改变。中药各剂量组肾脏外观较模型组体积缩小,颜色苍白程度减轻。HE染色显示中药组较模型组正常肾小球数目增多,肾小管扩张程度降低,炎性浸润减少,腺嘌呤结晶减少。Masson染色模型组蓝色胶原纤维沉积明显,蓝染区域的累积光密度值(IOD)差异有统计学意义(P<0.01),与模型组相比,中药各剂量组胶原沉淀相对减轻,中剂量和高剂量比较明显,具有统计学意义(P<0.01)。生化指标变化:与正常组比较,模型组血P、CREA、UREA水平升高显著,血Ca水平下降(P<0.01)。与模型组比较,第4周中药中剂量组血P、CREA、UREA水平下降(P<0.05),血钙上升(P<0.01),第8周中药各剂量组血P、CREA、UREA水平明显下降(P<0.01),血钙上升(P<0.01)。骨化三醇组第8周血P明显降低,血钙Ca升高(P<0.05)。血管钙化:茜素红染色显示中药组钙化减轻,中剂量和高剂量减轻较为明显。透射电镜下正常组可以看到平滑肌细胞结构完整,可见线粒体、内质网等细胞器形态正常,表面无沉积物。模型组和骨化三醇组组织结构完全破坏,有大量黑色钙化结晶沉淀。中药组各剂量组均有所缓解,中剂量和高剂量较为明显。钙化组平滑肌细胞完全破坏,异染色质增多,可以观察到模型组较为活跃的自噬过程,可见自噬双环体,并有大量钙化沉积。Western-Blot结果:主动脉ALP蛋白表达明显升高,α-SMA蛋白表达明显下降(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调、凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达上调(P<0.01),p-mTOR蛋白表达明显下降(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin 1蛋白表达上调(P<0.01);中药中剂量组、高剂量组主动脉ALP、Bax、Caspase-3蛋白表达降低、α-SMA、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),骨化三醇组,中药各剂量组主动脉LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.01,P<0.05),中药中剂量组、高剂量组mTOR蛋白表达升高、Beclin 1蛋白降低(P<0.01,P<0.05)。2.高磷诱导血管平滑肌细胞钙化模型的建立和评价,结果显示:经茜素红染色后镜下观察,正常组细胞形态正常,并未着色或呈现淡红色;高磷模型组出现大量细胞脱落,并有橘红的红色颗粒物形成,逐渐融合成片状或结节状,细胞形态改变,为圆形或不规则形,细胞出现皱缩,细胞浆内出现空泡,细胞折光度下降,有时局部可见到大片细胞脱落、死亡;并且随着磷浓度的增大,随着时间的延长,钙化的程度越严重。钙含量显示与磷浓度、时间有正相关性。凋亡抑制剂可以浓度依赖性的抑制平滑肌细胞的钙化。流式细胞仪检测显示随着天数增大凋亡率增大,与钙化呈正相关。ROS在第6天时含量最高,并随着时间的延长逐渐减弱。3补肾活血方在细胞水平对血管平滑肌细胞钙化的影响和机制研究,结果显示:经茜素红染色后镜下观察,正常组细胞形态正常,并未着色或呈现淡红色;高磷模型组出现大量细胞脱落,并有橘红的红色颗粒物形成,逐渐融合成片状或结节状,中药含药血清各剂量组和凋亡抑制剂组可以减少钙化结节的数量,并且具有浓度依赖性。DAPI染色结果显示模型组凋亡细胞增多。含药血清各剂量组,抑制剂组蓝色荧光相对较弱,中药含药血清中剂量,高剂量较为显著。流式细胞仪测各组细胞第九天凋亡率,模型组凋亡率显著升高,差异性显著(P<0.01,n=3)。相比模型组,抑制剂组,中药组凋亡率显著降低,(P<0.01,P<0.05)且中药组的作用呈剂量依赖性。中药组相比模型组能明显降低ROS含量。Western-bloting结果显示补肾活血含药血清能够降低ALP、Bax,Caspase-3,LC3-Ⅱ/Ⅰ,Becline1蛋白的表达、能升高α-SMA、Bcl-2的表达,可以激活p-Akt蛋白,p-mTOR信号蛋白的表达。结论:1.补肾活血方可以降低慢性肾脏病大鼠血磷水平,升高血钙,纠正钙磷代谢紊乱并且可以降低CREA、UREA水平改善肾功能;2.补肾活血方可以激活慢性肾脏病大鼠主动脉Akt信号蛋白,升高抑蛋白Bcl-2蛋白的表达,同时降低Bax,Caspase-3凋亡蛋白的表达;同时也可以激活信号蛋白m-TOR,抑制自噬相关蛋白的表达,透射电镜结果也显示过度的自噬促进了血管钙化的加重。而补肾活血方通过调控凋亡和自噬抑制慢性肾脏病大鼠主动脉的钙化。3.高磷可以成功诱导血管平滑肌细胞的钙化,具有浓度依赖性;凋亡抑制剂可以浓度依赖性的抑制平滑肌细胞的凋亡和钙化程度,说明凋亡参与了血管平滑肌细胞钙化的发生,ROS可能在钙化的早期介导了血管平滑肌细胞的凋亡。4.补肾活血方含药血清可以减少高磷诱导的血管平滑肌细胞的钙含量沉积,具有浓度依赖性;其机制①通过激活p-Akt信号蛋白的活性,抑制凋亡蛋白的表达,促进抑凋亡蛋白的表达抑制血管平滑肌的钙化;②激活p-mTOR的活性抑制自噬蛋白的表达,通过抑制自噬来改善血管平滑肌细胞的钙化。同时补肾活血方可以抑制ROS,具有抗氧化的作用。