【摘 要】
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研究目的: 通过双荧光素酶试验检测hTERT启动子在端粒酶阳性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的肿瘤特异性转录活性:运用基因重组技术构建hTERT启动子和SV40增强子调控的TRAIL基
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研究目的: 通过双荧光素酶试验检测hTERT启动子在端粒酶阳性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的肿瘤特异性转录活性:运用基因重组技术构建hTERT启动子和SV40增强子调控的TRAIL基因表达载体phTERT-TRAIL,并通过RT-PCR、Western blotting、流式细胞术(FCM)的方法检测其在MCF-7/ADR细胞中的肿瘤特异性表达,及通过形态学观察、FCM的PI染色法和AnnexinV-FITC/PI双标法检测其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的情况。 研究方法: 1.hTERT启动子靶向性转录活性的检测 以pRL-TK质粒作为内参照,将其与hTERT启动子启动的荧光素酶基因报告质粒phTERTluc1、阳性对照质粒pGL3-Control及阴性对照质粒pGL3-Basic分别共转染端粒酶阳性的MCF-7/ADR细胞和端粒酶阴性的HELF细胞。利用双荧光素酶测试系统,验证hTERT启动子在端粒酶阳性细胞中的特异性转录活性。 2.构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL 2.1 引物设计及PCR扩增目的基因TRAIL 设计包含HindⅢ和NheⅠ酶切位点的TRAIL特异性引物,以pEGFP-TRAIL为模版,PCR扩增可编码膜结合型TRAIL的长度为862bp的基因片段(含酶切位点)。 2.2 构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL 将TRAIL基因PCR扩增产物经HindⅢ和NheⅠ酶切、回收后,连接入经HindⅢ和XbaⅠ(NheⅠ的同尾酶)酶切的phTERTluc1中,连接产物转化大肠杆
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