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目的: 本研究构建了磨损微粒(wear particles,WP)刺激巨噬细胞的炎症反应模型,观察超高分子聚乙烯磨损颗粒(Ultra-high molecular weight polyethylene wear particles,UHMWPE-WP)诱导小鼠单核巨噬细胞产生炎症反应中炎症因子,尤其是晚期炎症蛋白高迁移率族蛋白 B1(high mobility group protein,HMGB1)表达的影响及可能的机制,为临床上人工关节无菌性松动的机制研究提供的理论基础和实验依据。 方法: 第一部分:磨损微粒诱导巨噬细胞炎症反应模型的构建 实验分为三组:①空白组;②模型组(WP 组);③阳性对照组(LPS 组)。 1. MTT 法检测各分组条件下的细胞活力。 2. ELISA 法检测细胞外周上清液中炎症因子的含量以分析炎症反应程度。 第二部分:磨损微粒对巨噬细胞炎症因子的影响及可能机制 实验分为五组:①空白组;②模型组(WP 组);③模型加 HMGB1 蛋白拮抗剂组(WP+A 组);④HMGB1 蛋白拮抗剂对照组(A 组);⑤阳性对照组(LPS组)。 1. ELISA 法检测细胞外周上清液中炎症因子的含量以分析炎症反应程度。 2. ELISA 法检测各组外周上清液中 HMGB1 蛋白含量,Western Blot 法检测细胞内 HMGB1 蛋白含量。 3. Western Blot 法检测细胞在各分组条件下 NF-κB p65 磷酸化影响。结果第一部分:磨损微粒诱导巨噬细胞炎症反应模型的构建1.MTT法分别测定LPS和WP对小鼠单核巨噬细胞细胞活力的影响,确定实验中LPS的适宜浓度为1μg/ml,WP的适宜浓度为250ng/ml。2.ELISA法测定各组细胞炎症因子的浓度,模型组与空白组相比,炎症因子TNF-α、IL-1和IL-6的浓度具有显著差异(P<0.05),说明模型构建成功,WP诱发炎症反应。模型组与模型加蛋白拮抗剂组的炎症因子浓度差异具有显著性(P<0.05),说明WP诱发的炎症反应与HMGB1的表达有一定的联系。第二部分:磨损微粒对巨噬细胞炎症因子的影响及可能机制1.ELISA法测定各组细胞外周上清液炎症因子浓度。模型组与空白组相比,炎症因子的表达具有显著差异(P<0.05),当加入拮抗剂HMGB1 A-box后,炎症因子含量降低。结果说明WP诱发的炎症反应与HMGB1的表达增多具有相关性。2.ELISA法测定各组细胞外周上清液HMGB1浓度,Western Blot法检测细胞胞内HMGB1表达量。模型组与空白组相比,HMGB1的表达具有显著差异(P<0.05),当加入拮抗剂HMGB1 A-box后,炎症反应程度降低同时HMGB1蛋白表达下调。上述结果说明WP诱发的炎症反应与HMGB1的表达增多具有相关性。3.Western Blot法检测WP对NF-κB p65磷酸化程度的影响,通过模型组与空白组对比发现,在WP刺激作用下,NF-κB的p-65的活化程度显著上升(P<0.05),HMGB1的表达上调与NF-κB活化具有相关性。结论磨损微粒可以诱导小鼠单核巨噬细胞产生炎症反应,上调小鼠单核巨噬细胞HMGB1蛋白的表达,其机制可能与NF-κB信号通路有关。