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[目的]探讨COX5A及其作用相关的SCN2B在小鼠脑老化进程中扮演的角色及其相关机制。[方法]1.本研究构建了全身过表达COX5A的转基因小鼠系,并对各品系COX5A转基因小鼠进行了表型分析。首先,采用逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)方法,检测COX5A在转基因小鼠不同脑区中的表达,计算出了COX5A在不同品系中的过表达率；然后,随机选取4月龄与12月龄的各品系转基因鼠,采用Morris水迷宫检测系统评价转基因小鼠的学习记忆能力；选取COX5A最高表达的品系,用神经电生理技术检测海马长时程增强(LTP)；并进行NeuN, GFAP, NF及COX5A的免疫组织化学染色,评价转基因鼠脑区的形态学改变；Golgi染色检测海马神经元及棘突的改变；运用RT-PCR检测了一系列脑老化相关基因的表达水平,这些基因包括BDNF, PDGF-B, TGF-p1, TGF-β2, IGF-1, bFGF, APP, SCN2B, AKT, ERK-1和GSK-3β。研究中以同月龄同窝野生型小鼠作为对照组,从行为学、形态学、分子生物学等不同层面,对过表达COX5A转基因小鼠进行全面的分析。2.在本研究的第二部分,我们分别构建了全身过表达SCN2B的转基因小鼠系以及全身低表达SCN2B的转基因小鼠系,并对各品系SCN2B转基因小鼠进行了表型分析。首先,采用RT-PCR及蛋白免疫印迹检测SCN2B在各品系转基因小鼠中的表达,检测了SCN2B过表达率以及表达抑制率,然后,随机选取4月龄与12月龄的各品系转基因鼠,运用Morris水迷宫检测系统评价转基因小鼠的学习记忆能力；选取SCN2B最高表达及最低表达的品系,运用神经电生理技术检测海马长时程增强(LTP)；并进行NeuN, GFAP, NF及SCN2B的免疫组织化学染色,评价转基因鼠脑区的形态学改变；Golgi染色检测海马神经元及棘突的改变；运用RT-PCR技术检测了一系列脑老化相关基因的表达水平,包括BDNF, PDGF-B, TGF-β1, TGF-β2, IGF-1, bFGF, APP, COX5A, AKT, ERK-1和GSK-3β。均以同月龄同窝野生型小鼠作为对照组,从行为学、形态学、分子生物学等不同层面,对高表达以及低表达SCN2B转基因小鼠进行全面的分析。[结果]1.本研究成功建立了5个过表达COX5A的转基因小鼠品系,首建鼠分别标记为Founder35, Founder22, Founder26, Founder28以及Founder46,其中,只有4个品系可以传代,不能繁育的Founder46弃用。各品系中COX5A蛋白的过表达率分别为58%,31%,20%和16%。对这4个品系4月龄及12月龄的转基因鼠进行表型检测,结果发现,与同窝野生型对照组相比,在过表达率最高Founder35转基因鼠这一品系中：i)水迷宫检测：隐蔽平台实验中逃避潜伏期明显缩短,转基因动物于撤除平台后在目标象限停留的时间显著延长；ii)海马的LTP兴奋性突触后电位(fEPSP)斜率明显增加(P<0.05)；iii)海马区NeuN, GFAP及NF的免疫阳性细胞数量无差异；iv)Golgi染色对海马区神经元的胞体大小、树突复杂性分析、近端及远端棘突数计数进行分析,均有统计学差异。RT-PCR检测多个老化相关基因在各品系过表达COX5A转基因小鼠的三个脑区(额前皮质、海马及基底前脑)的表达改变,结果发现Founder35及Founder22与野生型对照组有表达差异的基因,其中上调的基因包括BDNF、ERK-1、AKT、PDGF-B及IGF-1,下调的基因包括SCN2B、GSK-3β及bFGF;而在其他品系的COX5A过表达转基因鼠中未发现有差异表达的基因。2.成功建立了4个过表达SCN2B的转基因小鼠品系,首建鼠分别标记为Founder19, Founder41, Founder66以及Founder61,各品系SCN2B蛋白的过表达率分别为48%,32%,19%和17%。对这4个品系4月龄及12月龄的转基因鼠进行表型检测。水迷宫检测结果未发现任一品系与同窝野生型对照组有表现差异,在过表达率最高Founder19转基因鼠这一品系中：ⅰ)LTP兴奋性突触后电位,与对照组相比无统计学差异;ⅱ) NeuN, GFAP, NF及SCN2B的免疫阳性细胞数量与野生型组相比无差异；ⅲ) Golgi染色对海马区神经元的胞体大小、树突复杂性分析、近端及远端棘突数计数分析,未发现与野生型有统计学差异。RT-PCR检测多个老化相关基因在各品系过表达SCN2B转基因小鼠的三个脑区(额前皮质、海马及基底前脑)的表达改变,结果未发现与野生型对照组有表达差异的基因。3.成功建立了4个低表达SCN2B的转基因小鼠品系,首建鼠分别标记为Founder36, Founder41, Founder18以及Founder38,各品系SCN2B蛋白的表达抑制率分别为60.58%,53%,33%及30%。在SCN2B表达抑制率最高Founder36转基因鼠这一品系中：i)水迷宫检测结果发现Founder36与同月龄同窝野生型对照组相比,逃避潜伏期明显缩短,且撤除平台后在目标象限停留时间延长,具有统计学差异(P<0.05); ⅱ) LTP兴奋性突触后电位的斜率明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05); ⅲ)而NeuN, GFAP及NF的免疫阳性细胞数量与野生型组相比无差异；ⅳ) Golgi染色显示与野生型相比,转基因鼠近端树突复杂化有统计学差异(P=0.000, P<0.05); ⅴ) RT-PCR检测到不同脑区中有一些差异性表达的基因,其中上调的基因包括BDNF、ERK-1、COX5A、AKT及IGF-1,下调的基因包括GSK-3β及bFGF;而在其他品系的SCN2B低表达转基因鼠中上述检测指标与野生型组相比无差异。[结论]1.本研究成功构建了过表达COX5A转基因鼠、过表达SCN2B以及低表达SCN2B转基因鼠,各得到了不同程度COX5A过表达的转基因鼠品系及SCN2B过表达／低表达的转基因鼠品系；2. COX5A上调至正常时的58%可以明显改善转基因小鼠的学习记忆能力,其机制可能在于COX5A的表达增加促进了海马神经元的突触兴奋性、增加了海马神经元树突的密度、代偿性上调了脑老化过程中表达丢失或功能缺陷的线粒体酶、神经营养因子及其下游信号分子,并发现了与COX5A作用相关的SCN2B这一新分子；3. SCN2B过表达48%并不能引起转基因鼠的行为学、形态学、分子生物学等检测指标的改变,提示可能：ⅰ) SCN2B过表达48%的量不足以引起表型的改变；ii)过度表达SCN2B可能不是引起小鼠学习和记忆改变的必要的关键影响因素；SCN2B下调至正常时的60.58%可以明显改善转基因小鼠的学习记忆能力,其机制可能在于抑制SCN2B的表达：i)促进了海马神经元的突触兴奋性；ii)增加了海马神经元树突的密度；iii)代偿性上调了脑老化过程中表达丢失或功能缺陷的线粒体酶、神经营养因子及其下游信号分子。4. COX5A与SCN2B的表达在脑老化引发的认知功能减退中扮演重要的角色,有望成为抗衰老药物治疗靶点。