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目的:本研究针对Hp相关胃病,从宿主因素入手,分析宏观中医不同证型及微观COX-2-899G>C单核苷酸基因多态性和COX-2 mRNA转录水平表达与胃黏膜不同阶段病理类型的关联,试图一定程度揭示患者个体差异的实质,以期为胃癌癌前疾病以及胃癌的预判和演变起一定的警示作用。同时,中医证候作为辨证论治的核心,生物学实质尚待进一步探讨,本研究以Hp相关胃病为基础,试图寻找此类疾病中医不同证候的客观生物学依据。方法:一、病例来源:本研究标本为课题组成员于2014年9月至2017年1月在广州中医药大学第一附属医院内窥镜室及胃肠外科收集且符合纳入标准的患者及健康志愿者共451例。将临床病理标本分为正常组(病理未见明显异常)37例,炎症组151例,萎缩组(萎缩不伴肠化、异型增生组)58例,混合组(萎缩伴肠化、轻或中异型增生组)142例,重度异型增生组25例和胃癌组38例。同时对451例受试者进行辨证分型,包括脾胃湿热证139例,肝胃不和证152例,脾气虚证100例,瘀血内阻证37例及无证型(无临床表现,舌脉、气味、声音未见明显异常)23例。上述标本中180例进行COX-2基因表达检测实验,其中包括14例胃癌标本,并分别收集对应癌旁及远端组织各14例。二、胃黏膜标本采集:镜下未见病变者分别于胃窦距幽门口 2-3cm处大、小弯各钳取2块组织,共4块。发现病变时,在距离病灶2-3cmm处钳取4块组织。胃癌标本分别选取癌组织、癌旁组织及癌远端组织各4块。上述4块组织其中1块行快速尿素酶检测Hp感染,1块放入4%多聚甲醛液中固定,石蜡包埋切片行HE病理切片染色及Hp美蓝染色检测,2块分别放入装有RNA保存液的冻存管中,立即投入-80℃低温冰箱保存,用于COX-2-899基因多态及其mRNA的检测。三、Hp检测:采用快速尿素酶及胃黏膜切片美蓝染色法。显微镜下观察美蓝染色切片Hp感染。根据Hp诊断标准判断Hp感染情况。四、胃黏膜组织学评定:采用HE染色法,参照新悉尼病理诊断标准在光学显微镜下观察各组胃黏膜形态学变化,包括胃黏膜炎症、炎症活动程度、腺体萎缩、肠上皮化生、异型增生及胃癌改变。五、基因多态性检测:提取胃黏膜组织DNA,然后进行PCR扩增目标产物,电泳跑胶鉴定合格后采用直接测序法检测各组胃黏膜COX-2-899位点基因多态性。六、COX-2 mRNA表达:提取胃黏膜组织总RNA,逆转录成cDNA,针对COX-2设计引物序列,以ActinB为内参,进行荧光定量PCR实验。结果以2-△△Ct值计算COX-2基因表达情况。成果:一、一般资料(一)性别分布:本研究纳入样本性别分布无显著差异。(二)年龄分布:胃癌组平均年龄54岁,重度异型增生组平均年龄49岁,混合组平均年龄48岁,萎缩组平均年龄45岁,炎症组平均年龄44岁,正常组平均年龄41岁,年龄在组间差异具有统计学意义,P<0.01。(三)病程分布:在病程方面,炎症组(3.6年)、萎缩组(4.5年)、混合组(5.0年)病程与正常组(1.3年)比较有统计学差异(P<0.01),但三者相互之间无显著差异(P>0.05)。胃癌组、重度异型增生组与正常组比较无显著差异(P>0.05)。二、Hp感染与不同病理组别关系(一)Hp感染率:可见萎缩组>混合组>异型增生组>胃癌组=炎症组>正常组。与正常组比较,其余组Hp感染率分布有统计学差异,p<0.0033;与炎症组比较,萎缩组、混合组Hp感染率分布具有统计学差异,p<0.0033。(二)Hp感染程度:重度异型增生组Hp感染程度最为严重,其次为萎缩组、胃癌组、混合组、炎症组、正常组。Hp感染程度在其余各组分布均高于正常组,且具有统计学差异;并且与炎症组比较,萎缩组、混合组及重度异型增生组Hp感染程度分布具有统计学差异,P<0.05。三、中医证候与不同病理组别关系与正常组比较,其余各组中医证候分布组间具有统计学差异(P<0.05)。正常组在无证型中分布最高;炎症组、萎缩组、混合组、重度异型增生组及胃癌组在脾胃湿热证、肝胃不和证及脾气虚证中的比例均高于正常组(p<0.001)。瘀血内阻证中,胃癌组、萎缩组及混合组均高于正常组(P<0.001);其余各组间比较,中医证候分布无统计学差异(p>0.0033),但胃癌组分布于瘀血内阻证的比率高于其他病理组,炎症组分布于脾胃湿热证的比率高于其他病理组,混合组分布于肝胃不和证的比率高于其他病理组,重度异型增生组分布于脾气虚证的比率高于其他病理组。四、COX-2-899 G>C基因多态性与不同病理组别的关联(一)不同病理组别在COX-2-899 G>C基因型及等位基因的分布GG基因型分布频率呈胃癌组>重度异型增生组>正常组>萎缩组>混合组>炎症组,P>0.05(P=0.879);而G等位基因在各组分布频率为炎症组>胃癌组>重度异型增生组>正常组>萎缩组>混合组;C等位基因则在各组分布为混合组>萎缩组>正常组>重度异型增生组>胃癌组>炎症组,两等位基因在各组间分布比较无统计学差异,P>0.05(P=0.403)。(二)G、C等位基因与各组病理危险因素分析携带G等位基因发展为重度异型增生组及胃癌组可能是正常组的1倍,携带C等位基因发展为炎症组、混合组风险是正常组的近2倍,发展为萎缩组的风险是正常组的1倍,但OR分析无统计学差异(P>0.05)。(三)COX-2-899 G>C与不同性别病理组别的关联在女性中,等位基因分布有统计学差异(P<0.01),与正常组比较,携带C等位基因发生萎缩组及重度异型增生组的OR值分别是0.132(P=0.032)及0.067(P=0.015)。(四)COX-2-899G>C与Hp感染不同病理组别的关联Hp阴性组不同基因型病理的分布具有统计学差异(P=0.041),其中GG基因型分布呈重度异型增生组=萎缩组=混合组>正常组>炎症组>胃癌组,CC基因型则见胃癌组>炎症组>正常组>重度异型增生组=萎缩组=混合组。五、COX-2 mRNA表达与不同病理组别关系(一)COX-2 mRNA与不同组别不同病理组COX-2 mRNA表达无统计学差异,P>0.05,但可见萎缩组>炎症组>正常组>混合组>异型增生组>胃癌组的趋势。(二)COX-2 mRNA与不同基因型不同基因型COX-2 mRNA表达无显著统计学差异,P>0.05,可见COX-2 mRNA表达呈GG基因组>GC基因组>CC基因组的趋势。(三)COX-2 mRNA与不同证型COX-2 mRNA表达呈无证型组>脾胃湿热证组>瘀血内阻证组>肝胃不和证组>脾气虚证组,差异无统计学意义,P>O.05。(四)Hp感染与COX-2 mRNA表达情况Hp阴性COX-2 mRNA表达量高于Hp阳性组,未见显著差异,P>0.05(五)胃癌、癌旁、远端组织COX-2 mRNA表达COX-2 mRNA表达呈胃癌组>远端组>癌旁组,差异无统计学意义,P>0.05(P=0.507);COX-2 mRNA 表达见 GG 基因型>C Carry 基因型,P>0.05(P=0.458);COX-2 mRNA表达呈炎症组ca>胃癌组ca>萎缩组ca>重度异型增生组ca,混合组ca,组间无统计学差异,P>O.05(P=0.669)。六、胃病Hp感染、胃黏膜病理、COX-2-899基因多态性与中医证候关系(一)Hp感染与中医证候Hp感染率呈脾胃湿热证>瘀血内阻证>脾气虚证>肝胃不和证>无证型组。无证型组与其余各组比较,Hp感染率分布有统计学差异(P<0.005),但各组间比较无显著统计学差异。Hp感染程度呈瘀血内阻证>脾气虚证>脾胃湿热证>肝胃不和证>无证型组的趋势。相比无证型组,其余各组感染程度均有显著差异(P<0.005),但余各组间无显著统计学差异。(二)胃黏膜炎症与中医证候胃黏膜炎症程度呈瘀血内阻证>肝胃不和证>脾胃湿热证>脾气虚证>无证型组。与无证型组相比较,其与各组炎症程度均有显著差异(P<0.05),但余各组间无显著统计学差异(P>0.05)。Hp相关胃病胃黏膜炎症活动度方面,呈脾气虚证>瘀血内阻证>肝胃不和证>脾胃湿热证>无证型组,各组间分布无统计学差异(P=0.107)。(三)胃黏膜癌前病变与中医证候胃黏膜萎缩呈肝胃不和证>瘀血内阻证>脾胃湿热证>脾气虚证>无证型组。脾胃湿热证组、瘀血内阻证组、肝胃不和证组与无证型组存在统计学差异,P<0.05,但脾气虚证组与其无显著统计学差异;胃黏膜肠上皮化生呈瘀血内阻证>肝胃不和证>脾气虚证>脾胃湿热证>无证型组,瘀血内阻证与无证型组比较具有统计学差异,P<0.05,其余各组与之比较均无统计学差异;胃黏膜异型增生呈瘀血内阻证>肝胃不和证>脾气虚证>脾胃湿热证>无证型组,脾气虚证与无证型组比较无统计学差异,其余各组与之比较均有统计学差异,P<0.05。(四)COX-2-899 G>C基因多态与中医证候携带G等位基因发生瘀血内阻证风险是发生无证型的1倍。携带C等位基因发生脾胃湿热证、肝胃不和证风险是无证型的3倍,发生脾气虚证风险是无证型的2倍,分布无显著差异。结论:1.Hp相关胃病脾胃湿热证部分生物学实质可能与Hp感染胃黏膜,激活NF-κB信号通路,诱导COX-2表达,引起胃黏膜炎症有关,但对无Hp感染患者形成脾胃湿热证的实质仍需进一步探究;Hp相关胃病瘀血内阻证的生物学基础可能与Hp感染后引起严重胃黏膜癌前病变有关,但具体分子生物学指标有待进一步分析。2.携带C等位基因且表现为脾胃湿热证、肝胃不和证可能是胃癌发生的低危因素;携带G等位基因,Hp感染且表现为瘀血内阻证者是胃癌或严重的癌前病变的高危因素。3.胃癌前疾病转变为胃癌后,Hp感染率及感染程度都较前有所降低,伴随重要炎症指标COX-2 mRNA表达亦降低,提示胃癌变后炎症反应可能不是主导矛盾,其他复杂机制或许参与其中。4.由实证至虚证COX-2mRNA表达降低,提示COX-2可能参与“邪毒”Hp致病,机体抵御外邪的发生过程。5.中老年是胃癌及胃癌前病变的危险因素,提示该类人群可定期进行消化道肿瘤筛查。Hp感染是正常胃黏膜发展为病变胃黏膜的危险因素。胃癌前病变的发生与Hp感染率及感染程度存在一定联系。