β-细辛醚是中药石菖蒲挥发油的主要有效成分,其具有广泛的药理作用,尤其是对中枢神经系统。我们前期的实验表明,β-细辛醚能显著改善脑缺血再灌注损伤,其作用途径为：降低缺血再灌注损伤中的神经细胞凋亡和脑梗死体积。自噬作为第二种程序性死亡方式,在脑缺血再灌注损伤中起到重要的作用。但β-细辛醚是否能够通过影响自噬而改善脑缺血再灌注损伤?其作用机理是怎么样?β-细辛醚对神经细胞自噬的影响是否有靶向区域(脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区)?目前,还没有见到相关的报道。本实验主要由4个阶段组成,第一阶段：β-细辛醚单体的提取纯化及检测方法的建立；第二阶段：探讨在脑缺血再灌注大鼠中,脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区)自噬特征性指标Beclin1的动态表达及其在三个区域的异同。第三阶段：研究β-细辛醚对自噬特征性指标Beclin1和脑损伤衡量指标神经元特异性烯醇化酶的影响,探讨β-细辛醚是否通过影响自噬而减轻脑损伤。同时,将脑组织分为三个区域：脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区,研究β-细辛醚对自噬的作用是否有靶向区域；第四阶段：研究β-细辛醚调节自噬而减轻脑损伤的可能机理,重点研究JNK途径,同时研究β-细辛醚对脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区三个区域的调控机理是台存在异同。第一阶段实验目的：从中药材石菖蒲中提取、纯化β-细辛醚单体,并检测其纯度。方法：首先按《中国药典》附录挥发油提取方法提取石菖浦挥发油。取石菖蒲挥发油,采用冷冻结晶法进行纯化,得β-细辛醚白色晶体。建立GC/MS检测β-细辛醚纯度的方法,进行精密度试验、稳定性试验、重现性试验。另外,取部分我们从石菖蒲挥发油中提取纯化的β-细辛醚白色晶体,委托中国广州分析测试中心用GC/MS、 NMR、 IR检测,对其浓度进行验证。结果：在精密度试验中,β-细辛醚的纯度均值为99.56%,相对标准差为0.07%。在重现性试验中,β-细辛醚的纯度均值为99.52%,相对标准差为0.07%。在稳定性实验中,β-细辛醚的纯度均值为99.53%,相对标准差为0.06%。经GC/MS、NMR、 IR检测,证实其成分为β-细辛醚,纯度为99.55%。结论：本文建立的测定β-细辛醚的GC-MS方法操作简便,结果可靠,方法专属性、精密度均较好。本方法提示β-细辛醚30分钟内成分出峰完全；精密度实验中,β-细辛醚保留时间变异系数小于0.2%,相对含量的变异系数小于1%,提示仪器精密度良好。稳定性实验中,β-细辛醚保留时间变异系数小于0.3%,相对含量变异系数小于1%,提示120h内供试品溶液稳定性良好。重现性实验中,p-细辛醚保留时间变异系数小于0.3%,相对含量的变异系数小于1%,提示重现性良好。用本文建立的GC-MS检测方法,结果显示,能通过冷冻结晶法得到纯度>99%以上的β-细辛醚单体。第二阶段实验目的：相关报道已经证实,脑缺血再灌注损伤能够上调动物在体细胞的自噬特征性指标Beclin1水平,但Beclin1在大鼠的脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区)的动态表达情况如何,其在脑内各区域表达是否有异同,目前还未见报道。本阶段的实验目的是考察Beclin1在脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区的动态表达及其在三个区域的含量异同。方法：本实验选用大脑中动脉栓塞法模拟脑缺血再灌注损伤。将SPF级SD大鼠随即分为2组：正常组和模型组。其中模型组根据再灌注时间不同,分为6个业组,分别为再灌注0小时组,再灌注0.5小时组,再灌注4小时组,再灌注12小时组,再灌注24小时组,再灌注72小时组。在各时点,腹主动脉采血,断头取脑,同时将脑分为三个区域：脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区),分别检测各区域Beclin1含量,用ELISA检测血清中神经元特异性烯醇化酶含量,同时用透射电镜观察自噬体,用免疫组织化学法定性观察Beclin1.结果：1.三区域Beclin1动态表达情况：缺血区：实验结果表明,Beclin1含量在正常组中非常低。模型组中,Beclin1含量均显著上调(与正常组,有显著差异)。具体情况是：在缺血2小时后(再灌注0小时组),Beclin1含量显著上调；在再灌注24小时时Beclin1含量到达顶峰；在再灌注72小时时,Beclin1仍有较高含量。缺血半暗区和非缺血区：与缺血区类似,缺血2小时(再灌注0小时组),Beclin1显著上调,再灌注24小时时,Beclin1达到顶峰,在再灌注72小时时,Beclin1仍有较高含量。2.缺血损伤和再灌注损伤对Beclin1的影响：在未发生再灌注时(缺血2小时,再灌注0小时组),Beclin1含量显著高于正常组。而当发生再灌注(再灌注时间大于0.5小时),Beclin1含量较未灌注时,均显著上调。3.透射电镜观察自噬：通过透射电镜,我们观察到：缺血区、缺血半暗区、非缺血区均有大量自噬体的存在。而正常组脑组织中鲜见自噬体的存在4.免疫组织化学法定性观察Beclin1:免疫组化图显示,缺血再灌注损伤能引起Beclin1表达的上调。结论：1. Beclin1在缺血区、缺血半暗区、非缺血区的动态表达：缺血区、缺血半暗区、非缺血区三个区域Beclin1动态表达情况类似：在缺血2小时(再灌注0小时组)时开始显著上调,再灌注24小时达到顶峰,在再灌注72小时时仍有较高含量。2.缺血和灌注损伤对Beclin1勺影响：Beclin1上调与缺血损伤和再灌注损伤有关：前期上调主要与缺血损伤有关,后期主要与再灌注损伤有关。3.透射电镜进一步证实：缺血再灌注损伤能使脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区产生大量自噬体。4.免疫组化结果表明,缺血再灌注损伤能引起Beclin1表达的上调。第三阶段实验目的：前期我们的研究结果表明,β-细辛醚能减少神经细胞凋亡和坏死,从而减轻脑缺血再灌注损伤。但β-细辛醚对自噬的影响如何,是否能通过影响自噬而减轻缺血再灌注损伤?目前还未见相关报道。本阶段实验的目的是研究β-细辛醚对自噬特征性指标Beclin1和脑损伤衡量指标神经元特异性烯醇化酶的影响,探明其是否能通过影响自噬而减轻缺血再灌注损伤。同时,我们前期的实验表明,β-细辛醚在正常生理状况下,能透过血脑屏障,广泛分布于脑内。在脑缺血再灌注损伤中,β-细辛醚对自噬的影响,是台具有靶向区域(能靶向作用于脑的某个区域还是广泛作用于多个区域)?目前未见相关报道。因此,本部分实验将大鼠脑分为三个区域：脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区),分别检测各区域Beclin1的含量。考察β-细辛醚对3个区域Beclin1作用的异同,探讨其是否具有靶向作用区域。方法：本阶段实验选用大脑中动脉栓塞法模拟脑缺血再灌注损伤。实验分组：将SPF级SD大鼠随机分为5个组：正常组,模型组,β-细辛醚高剂量组[30mg/mL)、β-细辛醚中剂量组(15mg/mL)、β-细辛醚低剂量组(7.5mg/mL)。除正常组外,其余组均行大脑中动脉栓塞模型(缺血2小时,再灌注4小时)。腹主动脉采血,断头取脑,将大鼠脑分为三个区域：脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区),分别检测各区域Beclin1含量,用以衡量自噬水平；用ELlSA检测血清中神经元特异性烯醇化酶的含量,用以衡量脑损伤水平。结果：1.β-细辛醚对血清中神经元特异性烯醇化酶和大鼠神经功能积分的影响：与模型组比,在β-细辛醚高剂量组和中剂量组中,血清中神经元特异性烯醇化酶含量和神经功能积分显著降低；在低剂量组与模型组中,神经元特异性烯醇化酶和神经功能积分无显著差异；各模型组中血清中神经元特异性烯醇化酶含量和神经功能积分均显著高于正常组。2.β-细辛醚对Beclin1的影响：与模型组比,在β-细辛醚高剂量组和β-细辛醚中剂量组中,Beclin1含量显著下调。在低剂量组与模型组中,Beclin1含量无显著差异。各模型组中Beclin1含量显著高于正常组。3.β-细辛醚对缺血区、缺血半暗区、非缺血区Beclin1的影响：β-细辛醚能同时降低缺血区、缺血半暗区、非缺血区的Beclin1含量,且降低后的Beclin1含量在3个区域之间无显著性差异(高剂量、中剂量作用显著)。结论：1.β-细辛醚能下调Beclin1含量,且存在量效关系(高剂量、中剂量作用显著)。2.β-细辛醚能降低缺血再灌注脑损伤，且存在量效关系(高剂量、中剂量作用显著)。3.β-细辛醚对缺血区、缺血半暗区、非缺血区对自噬的作用强度是一致的。β-细辛醚能同时下调缺血区、缺血半暗区、非缺血区三个区域的Beclin1含量,其作用无靶向区域。提示β-细辛醚可能通过下调Beclin1含量而减轻脑损伤。第四阶段实验目的：前一阶段实验实验数据表明,在缺血再灌注脑损伤中,β-细辛醚能同时降低自噬特征性指标Beclin1和神经元特异性烯醇化酶的含量,提示β-细辛醚可能通过降低自噬而减轻脑损伤,且存在量效关系,并且对缺血区、缺血半暗区、非缺血区作用强度是一致的。但β-细辛醚是如何通过降低Beclin1,减轻脑损伤的?其作用机理尚不明确。本阶段重点研究β-细辛醚减轻缺血再灌注脑损伤可能的自噬机制。我们曾报道石菖蒲成分β-细辛醚能显著增强大鼠脑内c-fos的表达；石菖蒲能明显增高老年大鼠海马CA1区c-Jun基因的表达。而c-Jun基因的与自噬密切相关。我们近期研究又发现,在缺血性脑中风模型中,远离病灶区的神经细胞数量减少,而分别加入自噬抑制剂和石菖蒲提取物后,神经细胞数量的减少和脑功能均得到明显改善。我们推测作为石菖蒲主要药效成分的β-细辛醚,可能通过影响JNK, p-JNK, Bcl-2, Beclin1这一自噬通路进而减轻缺血再灌注脑损伤。同时,我们将脑分为缺血区、缺血半暗区和非缺血区,进一步探讨p-细辛醚对三区域作用机理的异同。方法：SPF级SD大鼠随即分为3组,模型组、β-细辛醚组(剂量根据上一阶段实验确定,中剂量)、JNK抑制剂组。3组均进行大脑中动脉栓塞模型。腹主动脉采血,同时将大鼠脑组织分为三个区域：脑缺血区(同侧顶叶皮质区以及同侧侧纹状体的一部分)、缺血半暗区(同侧额叶及同侧运动皮层)、非缺血区(对侧顶叶皮质区),分别检测各标本中JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin1含量,同时用透射电镜观察自噬体。结果：1.β-细辛醚和JNK抑制剂对JNK, P-JNK, Beclin1(?)Bcl-2的影响：与模型组对比,JNK抑制剂组和β-细辛醚组中的Beclin1, JNK和p-JNK含量显著下降,但Bcl-2的含量与前3个指标相反,是显著上调的。同时,JNK抑制剂组和β-细辛醚组之间,各指标含量无显著差异。Beclin1与Bcl-2和p-JNK/JNK的相关系数为-0.494和0.519。2.β-细辛醚和JNK抑制剂对缺血区、缺血半暗区、非缺血区的影响：β-细辛醚组和JNK抑制剂组中,三区域的JNK, P-JNK, Beclin1和Bcl-2含量均无显著差异。3.β-细辛醚对大鼠神经功能积分的影响：β-细辛醚和JNK抑制剂均能改善大鼠神经功能积分。结论：1. p-细辛醚能通过调节自噬进而减轻脑损伤,其可能机理为：β-细辛醚首先降低JNK含量,其次降低p-JNK含量,提升Bcl-2含量,进而降低Beclin1含量,降低自噬的表达,最终减轻脑损伤。2.β-细辛醚对缺血区、缺血半暗区、非缺血区的作用机理是类似的,从而进一步证实,β-细辛醚能广泛作用于脑组织,无靶向作用区域。总结论：用我们实验室的提取纯化方法,能从石菖蒲中得到β-细辛醚单体,该方法稳定可靠。脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区三个区域Beclin1动态表达情况类似：在缺血2小时(再灌注0小时组)时开始显著上调,再灌注24小时达到顶峰,在再灌注72小时时仍有较高含量。Beclin1上调与缺血损伤和再灌注损伤有关：前期上调主要与缺血损伤有关,后期主要与再灌注损伤有关。β-细辛醚能下调Beclin1和减轻脑损伤(高剂量、中剂量组作用显著),提示其可能通过下调自噬而减轻脑损伤。其可能的作用机理为：β-细辛醚首先降低JNK含量,其次降低p-JNK含量,提升Bcl-2含量,进而降低Beclin1含量,降低自噬的表达,最终减轻脑损伤。同时,我们发现β-细辛醚能同时下调缺血区、缺血半暗区、非缺血区三个区域的Beclin1含量,其作用无靶向区域。