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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常见的神经系统变性病之一,主要病理特征之一是脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)水平增高,在细胞外沉积形成老年斑。β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)是形成早期老年斑的主要成分,有明显的白聚集倾向和破坏作用。CRMPs (collapsin response mediator protein)是一类二氢嘧啶类磷蛋白,有5种亚型：CRMP1-5。CRMPs在神经系统中表达丰富,在神经发育过程中起着重要作用。在成年以后神经组织内主要表达CRMP2。研究表明CRMP2通过结合微管蛋白促进微管聚集,调节轴突生长。CRMP2的功能受多种蛋白激酶的磷酸化作用调节,其中T514位点磷酸化使CRMP2与微管蛋白二聚体结合的正常功能受损。目的采用全反式维甲酸诱导人神经成瘤细胞SH-SY5Y,细胞外给予聚集态Aβ1-42构建细胞损伤模型。观察聚集态Aβ1-42对细胞存活率、轴突生长状态、细胞微管结构及细胞内T514位点磷酸化CRMP2表达的影响。方法体外培养人神经成瘤细胞SH-SY5Y,细胞外给予全反式维甲酸诱导分化7天。制备聚集态Aβ1-42,对诱导后SH-SY5Y进行处理24小时。应用MTT法检测不同浓度Aβ1-42对细胞存活率的影响；采用细胞化学法观察Aβ1-42对细胞轴突生长状态的影响；运用免疫荧光细胞化学法观察Aβ1-42对细胞骨架微管结构和细胞内T514位点磷酸化CRMP2表达及分布的影响；应用Westen blot分析T514位点磷酸化CRMP2在细胞内表达水平的变化。结果1.体外培养人神经成瘤细胞SH-SY5Y,采用10μmol/L全反式维甲酸诱导分化7天后,在显微镜下观察到明显的形态学变化。细胞不再聚集成团,分裂明显减慢,开始向神经元分化：胞体由多角形变为椭圆形,形成一根或几根较长轴突,细胞呈现出明显的极性。对照组细胞生长迅速,仍维持上皮样细胞形态,无较长轴突形成。2.MTT试验结果显示,聚集态Aβ1-42具有一定的神经毒性作用,应用不同浓度(0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)处理能抑制细胞生长,存在一定剂量依赖性相关关系。在所选浓度中以0.1μmol/L及1μmol/L聚集态Aβl-42处理SH-SY5Y细胞时,可见细胞存活率较对照组显著降低(p<0.05)。选取对细胞活性存在显著性影响的0.1μmol/L及1μmol/L聚集态Aβ1442进行下一步实验。3.细胞化学法观察细胞突起生长状态结果显示：以0.1μmol/LAβ1-42浓度处理时细胞轴突长度与对照组相比无明显缩减(P>0.05)；以1μmol/L浓度处理24h后,细胞突起长度较对照组缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。4.免疫荧光分析结果显示：对照组细胞微管结构正常,绿色荧光(代表FITC标记α微管蛋白免疫阳性产物)在细胞核以外的胞浆及突起内分布均匀,红色荧光(代表TRITC标记的T514磷酸化CRMP2免疫阳性产物)主要分布于细胞浆,而在突起部分红色荧光表达较弱。应用0.1μmol/L和1μmol/L聚集态Aβ1442处理后,镜下可见细胞突起变短,部分微管网络结构模糊。统计分析显示,对照组与处理组细胞平均绿色荧光分布面积无显著性差异(p≥0.05); 1μmol/L处理组与对照组及0.1μmol/L处理组相比,细胞内平均绿色荧光强度明显减低(p<0.05)；两处理组红色荧光在细胞体及突起部位显示均增强,与对照组相比红色荧光强调度与分布面积存在显著性差异(p<0.05)。5.Westen blot结果显示使用聚集态Aβl442处理SH-SY5Y细胞24小时后T514位点磷酸化CRMP2表达量显著增加(p<0.05)；使用1μmol/L聚集态Ap1-42处理与0.1μmol/L聚集态Aβ1-42相比,T514位点磷酸化CRMP2表达量显著增加(p<0.05)。实验结果显示细胞外使用聚集态Ap1442处理后,细胞内T514位点磷酸化CRMP2在细胞内表达量增加。结论Aβ1-42可增加SH-SY5Y细胞内T514位点磷酸化CRMP2的表达,降低细胞存活力,损害细胞正常微管结构,影响细胞轴突生长延伸。